高二年级第二学期生物学科 总第 课时教案
课题: 第二节 分子生物学技术 pcr技术
使用时间: 主备人:
教学目标:
1、知识与技能:
1、了解PCR技术的基本操作2、理解PCR的原理3、讨论PCR的应用
2、过程与方法:
在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中,应避免外源DNA污染,严格控制温度等反应条件
3、情感态度价值观:
通过对PCR实验的操作及结果分析,培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神
教学重点:
PCR的原理和PCR的基本操作
教学难点:
PCR的原理
教学方法:
启发式教学
教具使用:
多媒体课件
共案部分
个案部分
教学过程
教师主导活动
学生主体活动
课前:
完成本章知识的梳理,及导学案中的自检题。检查汇总。
学生完成本章知识的梳理,做导学案中的自检题。
课中:
对上节课存在问题进行点拨。
新授:
根据学生自学情况,引导学生分析主要的问题。强调以下几点。
1.PCR技术的原理是什么?
2.进行PCR扩增时,向离心管中加入的是什么物质?
3.简述PCR扩增的过程。
4.为什么在聚合酶链式反应中要使用DNA聚合酶?
5.简述“目的DNA片段的体外扩增”的过程。
疑难解析
1.PCR技术的基本原理:类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93~C左右一定时问后,使模板DNA 链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性——退火——延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
2.PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种,即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
3.引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA NI补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
学生对上节存在问题进行讨论。
学生自学基础知识。
学生根据导学案内容讨论并展示个人、小组成果。
思考:
课后:
布置课外作业及下一节预习提纲。(见导学案)
学生完成课外作业及下一节预习。
板书设计
教学札记
三、其他补充教学资料(各位教师根据各班教学特点选择补充资料,可另附纸)
1.基础知识
PCR技术扩增DNA的过程,与细胞内DNA复制过程类似:
1.1细胞内DNA复制条件分析:
条件
组分
作用
模板
DNA的两条单链
提供复制的模板
原料
四种脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
酶
解旋酶
DNA聚合酶
打开DNA双螺旋
催化合成DNA子链
能量
ATP
为解螺旋和合成子链供能
引物
RNA
为DNA聚合酶提供合成的3’端起点
1.2细胞内DNA复制过程
(1)DNA结构:
核苷酸分子的结构与方向性:
由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链:
DNA双螺旋结构的反向平行结构:
(2)DNA的复制过程:
解 旋:解旋酶、ATP,DNA两条链打开,,形成两条DNA单链。
引物结合:在DNA单链3’端与DNA反向配对结合,确保引物3’端与DNA单链准确配对。
DNA聚合酶结合:
子链合成:DNA聚合酶从引物3’端开始,将配对的脱氧核苷酸连接起来。
后续加工:DNA聚合酶I将引物切去,并合成空缺处的DNA单链,再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来(半不连续合成。先导链,滞后链)
子链合成特点:不能从头合成;合成方向为“5’→3’合成”。
感悟生命的神秘:DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成,还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次,只有碱基配对无误后才能继续往下聚合,它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能,因此RNA的合成不需要引物,而是从头合成的,它的错配可能性较大,在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去,代之以高保真的DNA链。
[思考]DNA分子能准确复制的原因有哪些?
DNA双螺旋结构提供模板;碱基互补配对;DNA聚合酶的复查功能。
[思考]细胞内哪些物质是从头合成的?RNA合成、蛋白质合成。
1.3DNA分子复制的人工控制
解开螺旋:在80~100℃时,DNA双螺旋打开,形成两条DNA单链,称为变性。
恢复螺旋:在50℃左右时,两条DNA单链重新形成双螺旋结构,称为复性。
复制条件:缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。
反应场所:PCR仪(自动温度周期性调节)。
[思考]缓冲液相当细胞内的什么成分?(核基质)4.PCR的反应过程
变性:在95℃时DNA解旋
复性:在50℃时引物与DNA单链结合
延伸:在72℃时合成DNA子链(两个引物间的序列)
2.实验操作
2.1 PCR反应体系:缓冲液、DNA模板,四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物,水
2.2 实验操作步骤
2.3 按照PCR反应体系配方配制反应液;
(2)将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管(0.5mL)中;
(3)将微量离心管放到PCR仪中;
(4)设置PCR仪的工作参数。
(5)DNA在PCR仪中大量扩增。
2.4 水浴法:将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。
3.实验注意事项
3.1避免外源DNA污染:所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
3.2缓冲液和酶分装成小份,-20℃低温保存。
3.3每添加一种反应成分,更换一个移液器的枪头。
3.4混匀后离心处理,使反应液集中在离心管底部。
4.结果分析与评价
4.1反应液稀释:取2μLPCR反应液,添加98μL蒸馏水;2.分光光度计调零:将100μL蒸馏水添加到比色杯中,在260nm处将分光光度计调整读数为零。
4.2将100μL反应稀释液倒入比色杯中,测定在260nm处的光吸收值。
4.3计算:DNA含量=50×光吸收值×稀释倍数
高二生物PCR技术的原理和扩增的过程导学案
使用时间: 编制人:
一、学习目标
掌握PCR技术的原理和扩增的过程。
二、知识构成:
1.细胞内DNA复制条件分析:
条件
组分
作用
模板
原料
酶
能量
引物
2、DNA结构:
核苷酸分子的结构与方向性:
由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链:
DNA双螺旋结构的反向平行结构:
3、DNA的复制过程:解 旋: 酶、 打开,形成两条 单链。
DNA聚合酶结合:
子链合成:DNA聚合酶从引物3’端开始,将配对的 连接起来。
[思考]DNA分子能准确复制的原因有哪些?
[思考]细胞内哪些物质是从头合成的?
4、PCR是指 。
5、我国自1986年提出“ ”计划至今,在生物 技术方面已取得了一系列突破性的进展,许多成 果已转化为生产力。其成果主要表现在 、 、 等方面。
6、1985年,美国科学家等人成功的建立了在体外 的实验技术,被称为 ,简称 。
7、PCR体外扩增DNA的过程类似生物体内的 DNA复制的过程,两者都需要 、 、
、 ( 、 、 、 ),都需要
和 ,所不同的是 。
8、PCR对DNA的扩增具有 、 和 等特点。
9、进行PCR扩增时向离心管中加入的物质包括: 、 、 、
、 、 。
10、PCR扩增是在 中进行的,具体过程包括: 、 和 。此三步骤所需的温度分别是 、 、 。
11、运用PCR技术扩增DNA的过程中,变性的目的是 ;退火的目的是 ;延 伸的目的是 。
12、体外扩增DNA片段的反应程序是: 、 、 (以上过程循环 次)一 。
三、学法和自检:
需要DNA连接酶参与的过程有 ( )
A.DNA复制 B.DNA体外重组 C.DNA损伤的切除修复 D.RNA逆转录
课题 PCR技术的原理和扩增的过程
四、达标检测
1.DNA分子在复制时要先解旋,这时下列哪一对碱 基将从氢键连接处断开 ( )
A.腺嘌呤与尿嘧啶 B.腺嘌呤与胸腺嘧啶 C.鸟嘌呤与胸腺嘧啶 D.腺瞟岭与胞嘧啶
2.如果用重氢标记一个DNA分子,然后把这个DNA 进行扩增,扩增时所用的原料不含重氢,经10次复制后,含重氢标记的DNA数量将为 ( )
A.1个 B.2个 C.102/2个 D.(102/2)一1个
3·实验室内模拟生物体DNA复制所必须的条件是 下列的哪几个 ( ) ①酶②游离的脱氧核苷酸 ③ATP ④DNA 分子⑤mRNA⑥tRNA⑦适宜的温度 ⑧适宜的酸碱度
A.①②③④⑤⑥ B.②③④⑤⑥⑦ C·④⑤⑥⑦⑧ D.①②③④⑦⑧
4·(多选)PCR对DNA的扩增的特点是 ( )
A.快速 B.简便 C.专一性 D.零错误
5·以RNA为模板,按照RNA中核苷酸顺序合成 DNA(称逆转录),此过程中需要的酶是 ( )
A.DNA指导的DNA聚合酶 B.RNA指导的RNA聚合酶 C.RNA指导的DNA聚合酶 D.DNA指导的RNA聚合酶
6.参与DNA复制的几种酶的作用次序是 ( )
A.DNA解链酶一引发酶一DNA聚合酶一DNA连接酶一切除引物的酶
B.DNA解链酶一引发酶一DNA聚合酶一切除引物的酶一DNA连接酶
C.引发酶一DNA解链酶一DNA聚合酶一DNA连接酶一切除引物的酶
D.DNA解链酶一引发酶一切除引物的酶一DNA连接酶一DNA聚合酶
五、学习小结和课外作业:
1、学习小结:
2、上本作业:
3、课本或资料选题:
4、补充练习:
PCR技术是把某一DNA片段在体外酶的作用下,合成许许多多相同片段的一种方法,利用它能快速而特异的扩增任何要求的目的或DNA分子片段;电泳技术则是在外电场作用下,利用分子携带的净电荷不同,把待测分子的混合物放在一定的介质(如琼脂糖凝胶)中进行分离和分析的实验技术,利用它可分离氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等物质和作亲子法学鉴定。下图是电泳装置及相应电泳结果。请回答:
(1)电泳与叶绿体色素分离采用的纸层析法比较,后者使用的介质是 。电泳过程中分子的迁移速率除与本身所带净电荷的多少有关外,你认为还受什么因素影响(至少列出一种)?
(2)PCR技术能把某一DNA片段进行扩增,是依据什么原理?
(3)图3是把含有21个氨基酸的多肽进行水解,得到的氨基酸混合物进行电泳的结果,故可推知该多肽是由 种氨基酸构成的。
(4)图4是通过提取某小孩、其母亲以及待测定四位男性的DNA,分别由酶处理后生成含有若干DNA片段,并已进行扩增得到的混合物,然后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱,请分析:谁是该小孩真正生物学上的父亲?为什么?
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