2013年江苏栟茶中学高三生物考前赢分30天 第30天
1、DNA的粗提取与鉴定
（1）．思路：利用DNA与RNA、蛋白质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
（2）．原理
利用DNA的溶解性
①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl中溶解度不同，盐浓度为0.14mol/l时，DNA溶解度最小。
②DNA不溶于酒精溶液，某些蛋白质则溶于酒精。
利用DNA的耐受性
①蛋白酶水解：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。
②高温变性：大多数蛋白质不能忍受60℃—80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。
③洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
（3）．实验设计
①材料的选取：选用DNA相对较高的生物组织。
②细胞的破碎（以鸡血为例）
鸡血细胞 用玻璃棒搅拌 收集滤液。
③杂质的去除：方案之一是利用DNA在不同浓度的NaCl中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。
④DNA的析出：处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、95%冷却的酒精溶液可使DNA析出。
*动物材料：加水-过滤-加NaCl-加水-过滤-加NaCl-过滤-加酒精-搅拌析出（轻缓，以免DNA分子断裂）
*植物材料：碎——磨 （加洗涤剂和食盐）——滤（纱布，滤去杂质）——析（加冷酒精）
（4）．提纯方法
①盐浓度为0.14mol/l，DNA析出
②木瓜蛋白酶处理，去除蛋白质杂质
③60-75℃保温10-15min
④95%的冷酒精：蛋白质溶解，DNA不溶
⑤过滤、离心等
（5）．DNA的鉴定
DNA溶解在2 mol/l的NaCl溶液中 + 二苯胺试剂 溶液颜色变蓝。
对照组不加丝状物，其他与实验组相同
1、分离蛋白质的常用方法和原理
（1）凝胶色谱法
①概念：凝胶色谱法也称作分配色谱法 ，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
②原理：大多数凝胶是由多糖类化合物 构成的，如葡聚糖 或琼脂糖 。其内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长 ，移动速度较慢 ；而相对分子质量较大 的蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程较短 ，移动速度较快 。相对分子质量 不同的蛋白质因此得以分离。
缓冲液
①作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界的酸和碱 对溶液PH 的影响，维持PH值基本不变。
②配置：通常由1—2 种缓冲剂溶解于水中配置而成。调节缓冲剂的使用比例 就可以制得不同PH范围内使用 的缓冲液。
（3）电泳
①概念：带电粒子在电场 的作用下发生迁移 的过程。
②原理：许多重要的生物大分子，如多肽 、核酸 等都具有带电的基团，在一定PH下，这些基团会带上 正电 或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极 移动。电泳利用了分离样品中各种分子带电性质的差异 以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的 迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。
2、实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。
样品处理
血红蛋白由四个肽链组成，包括两个α-肽链和两个β-肽链。每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈红色。
红细胞的洗涤：
（I）目的：去除杂蛋白
（II）方法：低速短时间 离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆 ，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯中，再加五倍体积 的生理盐水，缓慢搅拌10min ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次 ，直到上清液没有黄色 ，表明红细胞已洗涤干净。
血红蛋白的释放：
将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水 到原血液的体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器 上充分搅拌10min。
分离血红蛋白的溶液：将搅拌好的混合8高速离心后，观察到试管中溶液分为四层
第1层：无色透明 的甲苯层
第2层：脂溶性物质 的沉淀层--白色 薄层固体
第3层：血红蛋白 的水溶液--红色 透明液体
第4层：其他杂质的暗红色 色沉淀物。
④透析：取1ml的血红蛋白 溶液装入透析袋 中，将其放入盛有300ml的20mol/L的磷酸缓冲液 中（PH为 7 ） （去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品中的缓冲液）
（2）凝胶色谱操作：
（1）凝胶色谱柱的制作：（略看）
（I）柱底部制作：
a．选择合适的橡皮塞，中间打孔
b．在橡皮塞顶部切出锅底状的凹穴 ，在0. 5ml的移液管 头部切下5cm 长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。
c．剪尼龙网小圆片覆盖在橡皮塞的凹穴 。用大小合适的100目 的尼龙纱将橡皮塞 包好，插到玻璃管上部一端。
d．色谱柱的下端用移液管头作出口部位，连接一细的尼龙管 ，并用螺旋夹 控制尼龙管的打开 与关闭 ，另一端放入收集色谱流出液 的收集器内。
（II）柱顶部制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞
（3）凝胶色谱柱的装填
（I）填充材料；交联葡聚糖凝胶 。
（II）方法：凝胶用蒸馏水 充分溶胀后，配成凝胶悬浮液 ，在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱 内
注意：色谱柱内不能有气泡 ，一旦发现，必须重装。
在20mmol/ L磷酸缓冲液（pH7.0）充分平衡凝胶12h
样品的加入和洗脱：
（I）加样前：打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液 下降到与凝胶面 平齐，关闭出口。
（II）加样：用吸管 将1ml透析后 的样品加到色谱柱的顶端 ，注意不要破坏凝胶面 。
*要求：沿管壁环绕移动，贴壁加样，不接触凝胶面，不破坏凝胶面
（III）加样后：打开下端出口 ，使样品渗入凝胶床内，等完全进入后，关闭下端的出口。小心加入缓冲液到适当高度 ，连接缓冲液洗脱瓶 ，打开下端出口，进行洗脱，待红色的蛋白质 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 ml 收集一管，连续收集。
（5）SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳
判断纯化 的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定，使用最多的是SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳 （掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小）
补差纠错
以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原理叙述正确的是（2008扬州一模）
A．红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的蒸馏水，重复洗涤三次
B．将血红蛋白溶液放在质量分数为O.9％的NaCl溶液透析12小时
C．凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在
D．蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢
解题规范
以下对 DNA 和血红蛋白的提取与分离（鉴定）实验的分析不正确的是(2008徐州二模)
A ．都要用猪血细胞来做实验
B ．在 DNA 的粗提取与鉴定试验中，有两次 DNA 析出，所用的方法相同
C ．在实验中都要进行除杂处理以便得到较纯净的 DNA 或血红蛋白
D ，将析出的 DNA 溶解在 2mol/L的 NaCI 溶液中，加入二苯胺试剂后呈现蓝色
考前赢分第30天 爱练才会赢
前日回顾
1．酵母菌的生长周期短，增殖速度快，是良好的实验材料。回答下列有关问题：
(1)在利用酵母菌判断细胞死活的实验中，被台盼蓝染液染成蓝色的是????????的酵母菌细胞。
(2)在探究“培养液中酵母菌种群数量变化”的实验中，需使用??????????? 在显微镜下对酵母菌细胞进行直接计数。向装有10mL培养液的试管中接种少量酵母菌菌种，在适宜条件下培养一段时间，酵母菌种群数量(Y)随时间(X)的变化情况最可能是????? ???????????。
(3)在果酒的工业制作过程中，接种完成后要先向发酵罐中通入一段时间的无菌空气后再密封，这样做的目的是??????????????? 。酵母菌利用葡萄糖发酵产生酒精的反应式是?????????????????????? 。果汁发酵后是否有酒精产生，可以用???????????? 试剂来检验，在果酒酿造过程中，如果果汁灭菌不严格，含有醋酸杆菌 ，在酒精发酵旺盛时，醋酸杆菌能否将果汁中的糖发酵为醋酸?????????????? 。
(4)在酵母细胞的固定化实验中，将干酵母放入? ????????中，使其活化，常用??????????????? 作载体包埋酵母细胞。
当天巩固
1．某同学以菜花为实验材料，进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，步骤如下：
步骤一：称取30g菜花，去梗取花，切碎。
步骤二：将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。
步骤三：在漏斗中垫上滤纸，将菜花研磨液过滤到烧杯中。在冰箱中放置几分钟，取上清液。
步骤四：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的某溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液。将絮状物缠绕在玻璃棒上。
请回答下列问题：
（1）请指出并改正该同学实验操作中的错误：___________________。
（2）步骤二的目的是使菜花细胞破碎，释放DNA，加入研磨液的主要成分有____和___等。（3）如要使步骤三所得上清液中杂质减少，可进行______操作后再置于冰箱。
（4）步骤四中所用两倍体积的某溶液为_________________，需“缓缓、轻轻地”搅拌溶液的原因是______________。
（5）简要说明鉴定步骤四所得絮状物是DNA的基本实验设计思路：____________________。
前日回顾答案： 1、 (1)死??? (2)血球计数板(显微计数板)??? C
(3)先供氧，以促进酵母菌的繁殖，使酵母菌的数目快速增加，然后让酵母菌进行无氧呼吸
?? ???重铬酸钾?不能 (4)水??? 海藻酸钠(聚丙烯酰胺，琼脂糖，明胶，醋酸纤维素，硝酸纤维素，答出一项即可)
当天巩固答案：1、（1）滤纸应改为纱布（或尼龙布）? （2）洗涤剂?? NaCl? （3）离心 （4）体积分数为95%的冷酒精??? 防止DNA断裂
（5）将絮状物溶于0.015mol/L（或2mol/L）的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴加热，观察颜色变化，同时用相应浓度的NaCl做对照实验。
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