一、微生物的分离与培养
1．培养基[判断正误]
(1)培养基只有液体培养基和固体培养基两种类型。 (×)
(2)培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分。 (√)
(3)在配制培养基时，除满足营养需求外，还应考虑pH、氧气及特殊营养物质的需求。 (√)
2．无菌技术[连线]
3．纯化大肠杆菌
(1)制备固体培养基的流程：
计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
(2) 微生物的接种方法：
①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
②稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面。
二、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数[判断正误]
(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。 (√)
(2)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源。 (√)
(3)统计样品中的活菌一般用平板划线法。 (×)
(4)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌。 (×)
三、分解纤维素的微生物的分离
1．纤维素酶
(1)组成：一种复合酶，它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
(2)作用：纤维素纤维二糖葡萄糖
2．筛选方法
(1)方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
(2)培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
3．实验流程
土壤取样：富含纤维素的环境
↓
选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量
↓
梯度稀释
↓
涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈
[知识体系构建]
①碳源、氮源、水、无机盐、生长因子 ②PH、氧气等 ③平板划线法 ④稀释涂布平板法 ⑤分解尿素的细菌,⑥选择培养基 ⑦酒精等化学药物 ⑧高压蒸汽灭菌,⑨显微镜直接计数
微生物的实验室培养
(1)(2011·重庆卷·T2A) 在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌。(×)
(2)(2011·重庆卷·T2BC) 在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长，向液体培养基中通入氧气能促进破伤风杆菌的生长。(×)
(3)(2010·山东卷·T34(2))对新配制的培养基灭菌时所用的设备是高压蒸汽灭菌锅。实验前需对超净工作台进行消毒处理。(√)
(4)(2009·安徽卷·T6A) 用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板(√)
(5)(2009·宁夏卷·T40(2)) 在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行灭菌；操作者的双手需要进行清洗和消毒。(√)
1．微生物的实验室培养
(1)培养基：
①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
②分类和应用：
划分标准
培养基种类
特点
用 途
物理性质
液体培养基
不加凝固剂
工业生产
半固体培养基
加凝固剂，如琼脂
观察微生物的运动、分类、鉴定
固体培养基
微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏种
化学成分
天然培养基
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
合成培养基
培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成)
分类、鉴定
用途选择
培养基
培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长
培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐)
鉴别培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴别不同种类的微生物，如可用伊红－美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)
③培养基中的营养要素：
各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐。此外还要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。
营养要素
来源
功能
碳源
无机碳源
CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物
①构成细胞中的物质和一些代谢产物；②既是碳源又是能源
有机碳源
糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等
氮源
无机氮源
NH3、铵盐、硝酸盐、N2等
将无机氮合成含氮的代谢产物
有机氮源
牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸
合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物
生长因子
维生素、氨基酸、碱基
①酶和核酸的组成成分；②参与代谢过程中的酶促反应
④制备：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
[关键一点]
(1)微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。
(2)对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。
(3)有些培养基不需要添加特殊营养物质，生物自己能合成，如大肠杆菌能合成某些维生素，作为特殊营养物质。
(2)微生物培养的无菌技术：
①消毒和灭菌的区别：
使用方法
结 果
常用的方法
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)
煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法等
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
②三种常用灭菌方法的比较：
灭菌方法
适用材料或用具
灭菌条件
灭菌时间
灼烧灭菌
接种环、接种针或其他金属工具
酒精灯火焰的充分燃烧层
直至烧红
干热灭菌
玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等
干热灭菌箱内，160 ℃～170 ℃
1 h～2 h
高压蒸汽灭菌
培养基等
高压蒸汽灭菌锅内100 kPa,121 ℃
15 min～30 min
2．微生物的纯化培养及菌种的保藏
(1)原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，即一个纯化的细菌菌落。
(2)方法：平板划线法、稀释涂布平板法。
方法
平板划线法
稀释涂布平板法
注意事项
(1)接种环的灼烧：
①第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物
②每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端
③划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者
(2)灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种
(1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1 cm～2 cm处
(2)涂布平板时：
①涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃
(3)划线时最后一区域不要与第一区域相连
(4)划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破
②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精
③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体
目的
在培养基上形成由单个菌种繁殖而来的子细胞群体——菌落
培养
平板冷凝后倒置培养，使培养基表面的水分更好地挥发，防止皿盖上水珠落入培养基造成污染
高考地位
微生物的分离、纯化和培养是微生物工程应用的基础，是近几年高考的重点和热点
命题角度
(1)以非选择题的形式呈现，以环境污染为背景考查培养基及微生物的培养条件等，如典例1；
(2)以选择题的形式考查微生物的培养基的种类及消毒灭菌等基础知识，如典例2。
[典例1] 某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种、培养及菌落观察与计数。请回答与此实验相关的问题。
(1)培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了________和________。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是________和________。
(2)对培养基进行灭菌，应该采用的方法是__________________________________。
(3)为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于________中培养，培养的温度设定在37℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种________作为对照进行实验。
(4)培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有________种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越________。
(5)如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐________细菌，这种培养基被称为________。
[解析] 培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压等。培养基在使用前要进行彻底的灭菌，多采用高压蒸汽灭菌。通过观察培养基上菌落的多少，可确定湖水细菌污染的程度，含高浓度NaCl的培养基可筛选出耐盐的细菌，这种培养基称为选择培养基。
[答案](1)氮源(碳源不作要求) 碳源 无机盐 水
(2)高压蒸汽灭菌
(3)恒温培养箱无菌水
(4)多 高
(5)盐(或NaCl) 选择培养基
[典例2] 用平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时 ( )
①可以用相同的培养基 ②都需要使用接种针进行接种 ③都需要在火焰旁进行接种 ④都可以用来计数活菌
A．①② B．③④
C．①③ D．②④
[解析] 选C 平板划线法或稀释涂布平板法都使用固体培养基，故①正确；平板划线法采用接种针进行操作，而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作，故②错误；纯化时，要进行无菌操作，需要在火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，故③正确；平板划线法一般用于分离而不是计数，故④错误。
微生物的分离与计数
(1)[2010·山东卷·T34(3)]测定培养液中微生物数量，可选用显微镜直接计数法。(√)
(2)(2013·太原五中月考(1))要从土壤中分离获取纤维素分解菌，应选用纤维素为唯一碳源的选择培养基。(√)
(3)(2013·许昌二次调研Ⅱ)在纤维素分解菌培养过程中，对培养基和接种环常采用的灭菌方法分别是高压蒸汽灭菌和灼烧灭菌(√)
(4)[2011·山东T34(4)改编]透明圈是刚果红与纤维素形成的复合物，可根据是否出现透明圈来判断有无纤维素分解菌。(√)
(5)(2009·安徽卷·T6D)在“检测土壤中细菌总数”的实验中，确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数。(×)
(6)[2009·宁夏卷·T40(3)] 若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的比例合适。(√)
1．筛选菌株的原理
微生物的选择培养：在选择培养基的配方中，把尿素作为培养基中的唯一氮源，只有能够利用尿素的微生物才能够生长；把纤维素作为培养基中的唯一碳源，只有能够利用纤维素的微生物才能够生长；在无氮源的培养基上，只有自生固氮菌才能够生长。
2．统计菌落数目的方法
(1)显微镜直接计数法：
①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。
②缺点：不能区分死菌与活菌。
(2)间接计数法(活菌计数法)：
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。 通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约 含有多少活菌。
②操作：
a．设置重复组，增强实验的说服力与准确性。
b．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300 的平板进行计数。
③计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。注意：统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
3．实验中的注意事项
(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。
(2)对照原则：
①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。
②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。
(3)在微生物数量测定时，应选取具有合适的菌落数的培养基，如细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有30～ 300个菌落数为宜；霉菌以每个培养皿内有10～100个菌落数为宜。
[小结] 选择培养基应用实例
①培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。
②培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。
③培养基中缺乏氮源时，可以分离出固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。
④当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，而使能够利用石油的微生物生存，得到能消除石油污染的微生物。
⑤改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。
高考地位
近几年本考点考查频率不高，但在一些一些省市的非选择题中有所涉及
命题角度
考题多以非选择题的形式出现，微生物的生存及培养结合在一起考查，通过生产生活中有关微生物计数、微生物分离与培养等实际问题进行考查，如典例3。
[典例3] 富集培养是微生物学中最强有力的技术手段之一。主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定环境条件使仅适应该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微生物的特点，从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。下图描述了采用富集方法从土壤中分离能降解对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。
(1)本实验所需培养基为_________________________________________________，
碳源为________________________。
(2)实验原理是_________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)①→③重复培养的目的是______________________________________。
(4)⑤的菌落中大部分是降解________的微生物。
(5)⑥为________组，⑦为________组，设置⑥的目的是________________________。
(6) ⑤→⑥采用________法，接种到⑥的培养基中，在操作过程中为防止污染应注意的事项是______________________________。
[解析] 富集培养的培养基是一种选择培养基，可用于具有某种代谢特点的微生物，本题就是为了选择出能分解对羟基苯甲酸的微生物。该实验的培养基的碳源为对羟基苯甲酸；全过程包括筛选―→扩大培养―→纯化―→鉴定。
[答案](1)选择培养基 对羟基苯甲酸 (2)利用以对羟基苯甲酸为唯一碳源的选择培养基，经富集培养，选择出能降解对羟基苯甲酸的微生物 (3)增大分解对羟基苯甲酸微生物的比例 (4)对羟基苯甲酸 (5)对照 实验 说明通过富集培养的确得到了欲分离的目标微生物 (6)单细胞挑取接种环在火焰上灼烧灭菌，烧红的接种环在空气中冷却，同时打开皿盖挑取菌种接种到试管中，并塞好棉塞，接种环在火焰上灼烧，杀灭残留物
[高考随堂体验]
1．(2012·北京高考)高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是( )
A. 将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中
B. 将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上
C. 将转基因植物叶片接种到无菌培养基上
D. 将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上
解析：选C 将转基因植物叶片接种到无菌培养基上，是植物组织培养的步骤之一，必须进行严格的无菌操作，否则会导致实验失败。
2．(2011·新课标全国卷)有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：
(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以___________________________
为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于________培养基。
(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即________________和______________。
(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力________。
(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和________。无菌技术要求实验操作应在酒精灯________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。
解析：(1)筛选目的菌株应使用选择培养基，可以在这类培养基中加入某种营养物质，促进所需要的微生物生长，这就是微生物学家常用的“投其所好”的策略。(2)平板划线法和稀释涂布平板法都可以将聚集在一起的细菌分散或稀释成单个细胞，进而得到单菌落。(3)目的菌株可分解原油，从而在培养基上形成以目的菌株为中心的分解圈，分解圈越大表明菌株的降解能力越强。(4)常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌，酒精灯火焰附近是一个无菌区，故实验操作在此处进行可防止周围环境中微生物的污染。
答案：(1)原油 选择
(2)平板划线法稀释涂布平板法
(3)强 (4)干热灭菌高压蒸汽灭菌火焰
3．(2009·上海高考)氯苯化合物是重要的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境。某研究小组依照下列实验方案(图1)筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌，培养基配方如表1。
表1 培养基的组成
液体培养基
蛋白胨
牛肉膏
氯苯
氯化钠
硝酸铵
无机盐(无碳)
蒸馏水
Ⅰ号
10 g
5 g
5 mg
5 g
—
—
1 L
Ⅱ号
—
—
50 mg
5 g
3 g
适量
1 L
Ⅲ号
—
—
20～80 mg
5 g
3 g
适量
1 L
(1)配制Ⅱ号固体培养基时，除添加Ⅱ号液体培养基成分外，还应添加1%的________。
(2)培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是________。
(3)从用途上来说，Ⅰ号培养基和Ⅱ号培养基分别属于______培养基和________培养基。在Ⅱ号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是________。
(4)在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为________。
(5)将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的Ⅲ号培养液中培养，得到生长曲线(如图2)。从图2可知SP1菌在________培养条件下最早停止生长，其原因是________。
解析：(1)固体培养基必须含有适量的琼脂。
(2)配制培养基时应先调pH后灭菌，灭菌后再调pH可能导致杂菌污染。
(3)Ⅰ号培养基是为了获得更多的菌株，属于通用培养基，Ⅱ号培养基是为了选择出SP1菌株，属于选择培养基，Ⅱ号培养基成分中含N物质为硝酸铵，则应由它为SP1菌株提供氮源。
(4)在恶劣环境下一些菌体会形成芽孢休眠体，来度过不良环境。
(5)SP1菌株以氯苯为碳源，当氯苯消耗尽，菌株因缺少碳源而不能继续生存，故氯苯含量越少，SP1菌株越早停止生长。
答案：(1)琼脂 (2)先调pH，后灭菌 (3)通用 选择 硝酸铵 (4)芽孢 (5)20 mg/L氯苯 碳源最早耗尽
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