幻灯片 1DNA的粗提取与鉴定
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幻灯片 2目的要求
1、了解从细胞中提取DNA的基本原理
2、初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法
3、观察提取出来的DNA
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幻灯片 3实验思路
1、DNA从哪提取？
2、怎样将DNA与细胞中的其他物质分离？
3、怎样鉴定我们提取的DNA？
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幻灯片 4实验原理
1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
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幻灯片 53.蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响
4.大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高温，而DNA在80°C以上才会变性
5.洗涤剂可以瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
6.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
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幻灯片 6实验材料和用具
实验材料：
1、鸡血细胞液（5~10ml）；
2、体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；
3、蒸馏水；
4、质量浓度为0．１g/ml的柠檬酸钠溶液； （抗凝剂）
5、物质的量浓度分别为2mol/L和0．015mol/L的NaCl溶液；
6、二苯胺试剂。
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幻灯片 7实验用具：铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（100ml，一个，50ml、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。
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幻灯片 8----
幻灯片 9----
幻灯片 108、DNA的鉴定
① DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂
②紫外灯照射法
A、配制染色剂，用蒸馏水配制万分之五的溴化已锭（EB）
B、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴EB溶液染色
C、将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射（暗室中），可见橙红色的荧光(DNA的紫外吸收高峰在260 nm处)
③甲基绿 （蓝绿色）
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幻灯片 11二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计
（一）实验材料的选取
材料：新鲜的鸡血
注意：
本实验中，要往鸡血中加入抗凝剂（柠檬酸钠溶液）
原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
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幻灯片 12(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞
(2)在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
1、破碎细胞
讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
利用了什么原理？
2、过滤，获取含DNA的滤液
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，可使鸡血细胞破裂，从而释放出DNA
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幻灯片 13①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜
2、植物细胞
讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解
②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液
讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等
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幻灯片 14（三）去除滤液中的杂质
为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理
讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？
答：可能含有核蛋白和RNA等杂质
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幻灯片 15讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质
答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质
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幻灯片 16讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？
答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离
方案二利用了酶的专一性；方案三利用了DNA的稳定性。
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幻灯片 17----
幻灯片 18（四） DNA的析出与鉴定
DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95％），静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水
1、DNA的析出
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幻灯片 19----
幻灯片 202、 DNA的鉴定
鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色
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幻灯片 21小结
1、DNA的粗提取与鉴定的方法
2、原理
3、实验设计的步骤，原则
作业
尝试用植物细胞（如新鲜的菠菜）来做这个实验。
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幻灯片 221、在制备鸡血细胞液的过程中，加入柠檬酸钠的目的是（ ）
A .防止凝血 B. 加快DNA析出
C .加快DNA溶解 D.加速凝血
A
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幻灯片 232、DNA的溶解度最低时，NaCl的物质的量浓度为（ ）
A 2mol/l B 0.1mol/l
C 0.14mol/l D 0.015mol/l
3、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（ ）
A 加快DNA溶解的速度
B 加快溶解杂质的速度
C 减小DNA的溶解度，加快DNA析出
D减小杂质的溶解度，加快杂质的析出
C
C
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幻灯片 244、向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中不断加入蒸馏水,在这个过程中DNA的溶解度变化情况分别是
A 减小;减小 B 增大;增大
C 先减小后增大 D增大; 减小
5、欲使溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，最有效的办法是
A 加蒸馏水 B 加矿泉水
C 加清水 D 加生理盐水
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幻灯片 256、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是
A 操作时缓慢滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度
B 操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整
C 加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度
D 当丝状粘稠物不再增加时，NaCl溶液的浓度可以认为是0.14mol/L
7、你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗？
用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。
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幻灯片 268、DNA遇二苯胺会染成（沸水浴）（ ）
A 硅红色 B 红色 C 紫色 D 蓝色
D
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幻灯片 27（一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取
三、实验案例
②鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长
1、鸡血细胞做实验材料的原因
①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得
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幻灯片 282、实验原理
① DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
② DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
③ DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
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幻灯片 294、课前准备鸡血细胞液
取质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）
①过程
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幻灯片 30②柠檬酸钠作用
防止血液凝固
③作用机理
柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固
鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液
④注意事项
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幻灯片 31讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？
答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆
5、方法步骤
将制备好的鸡血细胞液5 mL～10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。
①提取鸡血细胞的细胞核物质
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幻灯片 32----
幻灯片 33讨论：
答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破
（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？
（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？
答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA
（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？
答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA
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幻灯片 34②溶解细胞核内的DNA
将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态
沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 mol／L）
③析出含DNA的粘稠物
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幻灯片 36讨论：加入蒸馏水的目的？
降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出
将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕
注意事项：
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幻灯片 37④滤取含DNA的粘稠物
用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上
⑤将DNA的粘稠物再溶解
取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中
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幻灯片 38----
幻灯片 39⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液
取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中
⑦提取含杂质较少的DNA
在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95％的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA
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幻灯片 40----
幻灯片 41答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中
讨论：
（2）观察丝状物呈什么颜色？
答：白色
（1）为什么要加50mL的冷酒精？
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幻灯片 42取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0．015 mol／L的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化
⑧ DNA的鉴定
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幻灯片 43----
幻灯片 44讨论：
答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色
（2）这一鉴定结果说明什么问题？
（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？
答：提取出的丝状物是DNA
（3） DNA的直径约为20×10-10 m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？
答： DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的
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幻灯片 45----
幻灯片 46答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”
6、讨论：
①两次蒸馏水
第一次：细胞吸水胀破 第一步
第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步
（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？
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幻灯片 47过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为1－2层
②三次过滤
第一次： DNA存在于滤液里 第一步
第二次： DNA被留在纱布上 第四步第三次： DNA存在于滤液里 第六步
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幻灯片 48③两次析出
第一次：用0.14 mol／L 的NaCI溶液含杂质多
第三步
第二次：用冷却的95％的酒精
第七步
④六次搅拌：第一、二、三、五、七步
其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA
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幻灯片 49（2）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质
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幻灯片 50（二）案例二：以菜花为实验材料进行DNA的粗提取
1、课前准备
将新鲜菜花和体积分数为95％的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24 h
2、提取DNA的具体步骤
①取材：称取30 g菜花，去梗取花，切碎
②研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min
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幻灯片 51----
幻灯片 52③过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000 r/min的转速，离心2～5 min，取上清液放入烧杯中)。在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液
④沉淀：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95％的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀3～5 min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上
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幻灯片 53观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备
四、课题成果评价
（一）是否提取出了DNA
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幻灯片 54本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质
（二）分析DNA中的杂质
（三）不同实验方法的比较
对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好
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