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读读教材基础
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一、微生物的实验室培养
1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对________的不同需求，配制出供其生长繁殖的________。
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2．无菌技术
(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)关键：________。
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幻灯片 6(3)措施
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幻灯片 73.纯化大肠杆菌以及菌种的保藏
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤：计算→称量→溶化→________→________。
(2)纯化大肠杆菌
①原理：在培养基上将细菌稀释或分散成________，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。
②方法：________、________。
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(3)菌种的保藏
①短期保存：________上4℃保存，菌种易被污染或产生变异。
②长期保存：________中－20℃在冷冻箱中保藏。
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为什么在倒平板时，等平板冷却后要将平板倒置？
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二、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1．菌种筛选：使用尿素是唯一氮源的选择培养基培养。
2．统计菌落数目：常用方法有________、显微镜直接计数法。
3．细菌分离与计数的实验流程：土壤取样→配制________→微生物的培养与观察→细菌的计数。
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幻灯片 11三、分解纤维素的微生物的分离
1．纤维素酶
(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，它包括___________
________________________________________________________________________。
(2)作用
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幻灯片 122．菌种筛选
(1)方法：_________________________________。
(2)原理
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幻灯片 133．筛选流程
土壤取样：富含________的环境
↓
选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量
↓
梯度稀释
↓
涂布平板：将样品涂布于含CR的鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落：产生________的菌落周围出现透明圈
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幻灯片 14一、1.(1)营养物质 营养基质 (3)固体培养基 2.(2)防止外来杂菌的入侵 (3)煮沸 灼烧 高压蒸汽 3.(1)灭菌 倒平板 (2)①单个细胞 ②平板划线法 稀释涂布平板法 (3)①固体斜面培养基 ②甘油瓶
二、2.稀释涂布平板法 3.培养基
三、1.(1)C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶 2.(1)刚果红染色法 (2)是否产生透明圈 3.纤维素 纤维素酶
[想一想] 提示：将平板倒置的目的是防止培养皿盖上的水珠滴落到平板上造成污染。
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1．教材第17页倒平板操作的讨论
(1)培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
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幻灯片 16(2)为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(3)平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
(4)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
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幻灯片 172．教材第18页平板划线操作的讨论
(1)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
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(2)在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
(3)在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
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3．教材第22页两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数106的培养基中，得到以下两种统计结果：1. 第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；2.第二位同学在该浓度下涂布了三个平板统计的菌落数分别为20、200、239，并且取平均值153作为统计结果。
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第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。
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研研核心要点
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1．培养基的成分
(1)碳源
①含义：能提供碳元素的物质。
②作用：构成生物体的物质，异养生物的能源物质。
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幻灯片 24③主要来源
无机物：CO2、NaHCO3。
有机物：糖类、脂肪酸、石油、花生粉饼等。
(2)氮源
①含义：能提供氮元素的物质。
②作用：合成蛋白质、核酸以及含氮代谢产物。
③主要来源
无机物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐。
有机物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等。
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(3)生长因子
①含义：生长不可少的微量有机物。
②作用：酶和核酸的成分。
③主要包括：维生素、氨基酸、碱基等。
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(4)水
①含量：在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高。
②作用：不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定。
③主要来源：培养基、大气、代谢产物等。
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(5)无机盐
①含义：为微生物提供除C、H、O以外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素。
②作用：细胞内的组成成分，生理调节物质；某些化能自养菌的能源、酶的激活剂。
③主要来源：培养基、大气等。
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幻灯片 282．常见的消毒和灭菌方法
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[师说·一语破天机]
该考点在高考中主要考查微生物的消毒和灭菌，在2011年全国课标卷中做了重点考查，预计在2014年高考中还有可能考查。
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[选题·典型中选秀]
例1：[2011·新课标全国卷]有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染，某同学欲从污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：
(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于________培养基。
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(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即________和________。
(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力________。
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(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和________。无菌技术要求实验操作应在酒精灯________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。
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[破题·分层揭秘密]
(一)明确解题思路
实验目的是为了筛选出可以分解原油的高效菌株，因此在筛选的时候选择培养基的碳源为原油。纯化分离微生物的方法有两种：平板划线法和稀释涂布平板法；灭菌的方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
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(二)调动和运用知识解题
(1)原油 选择
(2)平板划线法 稀释涂布平板法 (3)强
(4)干热灭菌 高压蒸汽灭菌 火焰
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幻灯片 36(三)同类互动探究
(1)若在该培养基中加入青霉素，能更好地起到筛选作用吗？
提示：不能。
分析：青霉素培养基往往是真菌选择培养基，在加青霉素的培养基中，细菌生长被抑制，因而不能筛选出能高效降解原油的菌株(细菌)。
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幻灯片 37(2)细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理方法，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌？
提示：培养基、手、接种环。
分析：高压蒸汽灭菌的设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。
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1. 原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。
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幻灯片 392．微生物接种方法
(1)平板划线法：平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。(如下图)
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(2)稀释涂布平板法
10倍系列稀释操作
①将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。
②用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次，使菌液与水充分混匀。
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幻灯片 41③从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复②步混匀操作。依次类推，直到完成最后1支试管的稀释。
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[师说·一语破天机]
本考点内容常以环境污染为背景考查微生物的生存条件及分离、纯化和培养条件等，复习中引起关注。
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幻灯片 44[选题·典型中选秀]
例2：从自然界微生物中筛选某菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。
(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化、培养噬盐菌的菌样应从________环境中采集。
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幻灯片 45(2)富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择________的培养基，并在________条件下培养。
(3)接种前要对培养基进行________处理。在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在________条件下进行。
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幻灯片 46(4)如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体方法。
获得图A效果的接种方法是________，图B效果的接种方法是________。一同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是________________，应当怎样操作才可避免此种现象？
_______________________________________________。
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幻灯片 47
(5)如果探究温度对纤维素酶活性的影响，自变量是________，应该保持________等不变(至少答两项)。
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幻灯片 48[破题·分层揭秘密]
(一)明确解题思路
(1)筛选菌种应从适于目的菌种生长、繁殖的环境中寻找，故培养噬盐菌应从高盐环境中采集。
(2)富集培养时培养基及培养条件应能促进目的菌的生长、繁殖。
(3)微生物的分离及培养中必须保证无菌，包括培养基的灭菌和操作过程的灭菌等。
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幻灯片 49(4)纯化培养中接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，前一种方法形成的菌落分布较均匀，后一种方法形成的菌落分布不均匀，先划线的部分菌落密集甚至相连，后划线的部分菌落分布稀疏。
(5)探究温度对酶活性的影响时，温度为自变量，酶活性为因变量，其他变量如底物和酶的用量、pH、反应时间等均为无关变量。
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幻灯片 50(二)调动和运用知识解题
(1)海滩等高盐 (2)以淀粉为唯一碳源 高温
(3)高压蒸汽灭菌 无菌
(4)稀释涂布平板法 平板划线法 菌液浓度过高 增大稀释倍数(或培养过程被杂菌污染 严格无菌操作；或用接种环划下一区域前接种环没有灭菌 每划一个新区域前都要对接种环进行灭菌处理)(原因与操作要对应)
(5)温度 纤维素的量与浓度、反应时间、pH
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幻灯片 51(三)同类变式训练
如图表示平板划线法分离纯化细菌示意图。根据所学生物学知识，完成下列问题。
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幻灯片 52(1)微生物所需的营养成分一般包括________、________、水和无机盐。
(2)培养微生物时，除考虑微生物生长所需的营养外，还要考虑微生物生长所需的温度、______以及是否需要O2等。
(3)对培养基进行灭菌时，多采用________法，而对接种环或涂布器灭菌时则用________法。
(4)平板划线时，为保证每次划线都从上次划线末端的微生物浓度开始，所以每次划线前都要________，平板划线结束后，最后一次划的线不能与第一次划的线________。
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幻灯片 53(5)脲酶可以将尿素分解为NH3，从而使尿素溶液pH升高，这可用________试剂来检验。用纤维素作唯一碳源的培养基培养微生物，得到的纤维素分解菌中可能还混有________。
答案：(1)碳源 氮源 (2) pH
(3)高压蒸汽灭菌 灼烧灭菌
(4)对接种环灼烧灭菌 相交(相接、相连、交叉等)
(5)酚红 自养微生物(硝化细菌)
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幻灯片 54解析：(1)(2)培养基中一般含有水、无机盐、碳源、氮源等物质；培养基中除含有营养物质外还需提供适宜的温度、pH、O2等。(3)培养基常采用高压蒸汽灭菌，玻璃器皿常采用干热灭菌，接种环等金属器具常采用灼烧灭菌。(4)考查平板划线法的操作方法，如果划线相重合则不能分离出纯种。(5)酚红可检验碱性溶液，用纤维素作唯一碳源的培养基培养微生物，得到纤维素分解菌，但自养微生物可以利用空气中的CO2作为碳源，也能生存，需要进一步分离。
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1．筛选菌株
(1)原则：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
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幻灯片 56(2)菌株筛选原理的比较
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2.统计菌落数目的方法
(1)显微镜直接计数法
①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
②方法：用计数板计数。
③缺点：不能区分死菌与活菌。
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幻灯片 58(2)间接计数法(活菌计数法)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
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幻灯片 59
③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
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[师说·一语破天机]
本部分知识常与前面两考点综合在一起考查，单科试卷中多有涉及，理综考试中多以填空形式出现。
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幻灯片 62[选题·典型中选秀]
例3：下面是探究如何从土壤中分离自生固氮菌与计数的实验，完成下列问题：
实验原理：农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表层土壤制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离。
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材料用具：农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛有9mL无菌水的试管、无菌吸管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛有90mL无菌水的锥形瓶、恒温箱。
(1)方法步骤：
①倒平板：分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，应在________操作。
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②制备土壤稀释液：取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1 mL，转至盛有9 mL的无菌水的试管中，依次稀释到107稀释度。
③涂布：按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布________个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布________个。
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幻灯片 65
④培养：放入恒温箱内，在28℃～30℃下培养3 d～4 d。
⑤细菌的计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。如果测定的平均值为50，则每克样品中的菌落数是________。(稀释度是105)
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幻灯片 66
(2)预期结果：相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数________ (填“多于”或“少于”)无氮培养基上的数目。原因是________________________________________
________________________________________________________________________。
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幻灯片 67[破题·分层揭秘密]
(一)明确解题思路
在酒精灯火焰旁倒平板，可以减少杂菌污染。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值，则每克样品中的菌落数为(50÷0.1)×105＝5×107。牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，以消除无关变量对实验结果的影响，该培养基适合其他细菌生存，所以，它比无氮培养基上的菌落数目多。
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幻灯片 68
(二)调动和运用知识解题
(1)①酒精灯火焰旁 ③3 1 ⑤30～300 5×107 (2)多于 无氮培养基上只有土壤中的自生固氮菌生存繁殖，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类生存
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幻灯片 69
(三)同类互动探究
(1)据上题可知，在稀释涂布平板法中，为何需涂布三个平板？
提示：对照作用、减少实验误差等。
分析：一是作为对照实验，判断实验操作的准确性；二是作为重复实验，统计时取平均值，以减少实验误差。
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幻灯片 70
(2)用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比如何？
提示：比实际值低。
分析：培养基上的一个菌落也可能由相连的两个或多个菌体繁殖而来，因此统计的活菌数要少于菌体实际值。
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随堂对点练习
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幻灯片 721.[2012·北京理综，5]高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是( )
A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中
B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上
C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上
D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上
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幻灯片 73
答案：C
解析：考查微生物的培养和应用，实验分析能力。将转基因植物叶片接种到无菌培养基上，是进行植物组织培养，必需严格的无菌操作，否则会失败。
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幻灯片 742. 饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，并且影响对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以被动物吸收利用的磷酸盐等。如图是科研人员从作物根部土壤中分离产生植酸酶的菌株的过程示意图。请分析作答：
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(1)培养基中除了添加植酸钙以外，应含有________、________、水、无机盐等基本营养物质。
(2)为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿等进行________，其中，培养基的制备过程中灭菌之前要进行________。
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幻灯片 76(3)接种以前进行的一系列操作，目的是在培养皿表面形成________。根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的________就能大致推测出样品中的活菌数。
(4)由于植酸钙不溶解，使培养基形成白色浑浊状态。产生植酸酶的菌株会水解植酸钙，菌落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断该菌是否产生植酸酶。实验结果显示A～E五种菌株中，________是产生植酸酶的理想菌株。
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幻灯片 77
(5)获得目的菌以后，若要用于植酸酶的生产，还需要进行________。
答案：(1)碳源 氮源
(2)(高压蒸汽)灭菌 调pH
(3)单个菌落 菌落数
(4)E (5)扩大培养
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幻灯片 78解析：(1)从土壤中分离培养产生植酸酶的菌株的过程中，培养基中加入植酸钙，以筛选所需要的微生物，此外还要有充足的碳源和氮源等营养物质。(2)实验的灭菌方法一般有：灼烧灭菌(接种环、接种针或其他金属用具)、干热灭菌(玻璃器皿和金属用具等)、高压蒸汽灭菌(培养基和培养皿)。其中，培养基的制备过程中灭菌之前要调pH。
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幻灯片 79(3)当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。(4)根据题干提供的信息，E的周围形成的透明区域最大，是产生植酸酶的理想菌株。(5)获得目的菌以后，若要用于植酸酶的生产，还需要进行扩大培养。
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