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幻灯片 2 一、微生物的培养
1.培养基
（1）概念：人们按照微生物对 营养物质 的不同需求，配制出的供其 生长繁殖 的营养物质。
（2）成分：尽管培养基的配方各不相同，但其基本成分都包括水、碳源、氮源和无机盐 。还需满足不同微生物生长对 pH 、特殊营养物质以及氧气的要求。
（3）培养基配制的程序：计算→称量→溶化→ 调pH→灭菌→倒平板。
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幻灯片 32.无菌技术
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幻灯片 4 3.微生物培养的基本技术
（1） 纯化大肠杆菌的原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个菌落，会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落 。菌落是鉴定菌种的重要依据。
（2）微生物的纯化培养方法（两种接种方法）
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幻灯片 5 4.菌种的保藏
（1）临时保藏：放入4℃冰箱，保存3～6个月，转入新的培养基。
（2）长期保存：甘油管藏法，放在-20℃冰箱保存。
二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.分离原理：土壤中能够分解尿素的细菌体内能合成脲酶，能够把尿素分解成无机物供细菌生长繁殖。
2.过程：土壤取样→ 制备培养基→微生物的培养与观察→细菌的计数。
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幻灯片 6 3.细菌的计数：统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
三、分解纤维素的微生物的分离
1.纤维素酶的组成：纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
2.分离原理：土壤中的能够分解纤维素的微生物体内具有纤维素酶，能够把纤维素分解成葡萄糖，供微生物生长发育。
3.鉴别方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
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幻灯片 7 1.培养基配制的程序及注意事项
（1）程序：计算→称量→溶化→调pH→灭菌→倒平板。
（2）注意事项：
①全程要求无菌操作。
②培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶来估计培养基温度。
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幻灯片 8 ③平板需倒置：平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
④操作时使锥形瓶的瓶口通过火焰，通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
（3）培养基内所需的其他条件：①pH；②特殊营养物质，如：在培养基中添加维生素；③氧气的含量，如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件。
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幻灯片 9 2.培养基的种类
（1）按培养基的物理性质划分
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幻灯片 10（2）按培养基的功能划分
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幻灯片 11 a.加入培养基的凝固剂（琼脂），一般不能被微生物利用，仅仅起到凝固作用。
b.选择培养基一般只生长具有特定目的的微生物，鉴别培养基可以鉴别特定的微生物，也可以存在其他微生物。
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幻灯片 12 3.微生物的纯化培养（两种接种方法）
（1）平板划线法：操作简单，但是单菌落不易分离。
①原理：线条末端细菌的数目比线条起始处要少，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
②无菌操作：在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环。第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种。
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幻灯片 13 ③注意事项：划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
（2）稀释涂布平板法：操作复杂，但是单菌落易分离。
①原理：细菌的数目随着稀释倍数增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
②无菌操作：所有操作都应在火焰附近进行，对涂布器等接种器具进行消毒和灭菌。
③统计实验结果：选取菌落数介于30～300个之间的平板进行计数。每一个稀释度下至少涂布三个平板作为重复组，不同稀释度下涂布的平板形成对照组。
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幻灯片 14 a.在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。
b.不同细菌的菌落特征不同，菌落是鉴定菌种的重要依据。
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幻灯片 17 蛋白胨含有维生素、糖和有机氮等营养物质，在培养基中主要是作为氮源，微生物的培养基各种配方一般都要含有水、碳源、氮源、无机盐。实验室的灭菌方法一般有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌（适合于培养基等物体的灭菌）。要想使微生物快速繁殖，就要置于适宜的条件下，特别是温度，所以要置于恒温培养箱中，对照实验就是要设置一个无菌的加以比较，进行观察。不同的细菌形成的菌落具有不同的形态，细菌菌落的特征是识别不同细菌的主要依据。菌落是由一个细菌细胞繁殖而来的，菌落多则说明细菌的种类多。加入了特定的物质，用于筛选各种特定细菌的培养基就是选择性培养基。例如加入了NaCl就可以用于筛选耐盐细菌。
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幻灯片 18 （1）氮源（碳源不作要求） 碳源 无机盐 水 （2）高压蒸汽灭菌 （3）恒温培养箱 无菌水
（4）多 高 （5）盐（或NaCl） 选择性培养基
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幻灯片 19 1.菌株筛选原理的比较
（1）土壤中分解尿素的细菌：常用选择培养基进行筛选，即提供有利于目的菌株生长的条件，如营养、温度、pH等，同时抑制其他微生物的生长。
（2）分解纤维素的微生物：刚果红染色法，即在含有纤维素的培养基中加入刚果红，刚果红与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被分解后，该复合物不能形成，培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
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幻灯片 20 2.统计菌落数目的方法
（1）显微镜直接计数法：用血细胞计数板，在显微镜下直接观察计算一定体积的微生物数量。其缺点：不能区分死菌和活菌。
（2）间接计数法：稀释涂布平板法（常用方法）。
3.细菌的计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。
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幻灯片 21 4.实验结果及分析
（1）是否有杂菌污染及是否筛选出菌落
对照组的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。
（2）样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。
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幻灯片 22 （3）重复组的结果是否一致
如果选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要分析产生差异的原因。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过设置对照实验来证明。实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
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幻灯片 23 a.显微镜计数法计算的细菌中包括死细菌。稀释涂布平板法计数的是活菌数。
b.稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目要低。
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幻灯片 24 （2010·泰州模拟）同学们为了探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌（目的菌）。培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示。请分析回答问题：
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幻灯片 27 选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制其他微生物的生长，促进所需微生物的生长，筛选目的菌可用选择培养基。尿素是培养基中的唯一氮源，因此只有能够利用尿素的微生物才能够生长。由于细菌合成的脲酶将尿素分解为氨,pH增高，故在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，其将变红；目的菌生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的尿素、葡萄糖。
(1)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，pH增高，使酚红指示剂变为红色 （2)目的菌 选择 （3)尿素、葡萄糖 为目的菌提供氧气
（4)涂布平板法（或划线法）
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