幻灯片 1专题2 微生物的培养与应用
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一、微生物的分离与培养
1．培养基的概念：指按照微生物对营养物质的不同需求，配制的供其生长繁殖的营养基质。包括 、半固体培养基和 。
2．培养基的营养构成：各种培养基的基本配方一般都有水、碳源、氮源和无机盐。
固体培养基
液体培养基
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幻灯片 44．平板培养基的制备：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
5．实验操作
(1)倒平板操作
①培养基需冷却至 左右时开始倒平板。
a．原因：琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板高于50 ℃则会烫手，低于50 ℃时若不能及时操作，琼脂会凝固。
b．估计培养基温度的方法：培养基从灭菌锅中取出冷却一段时间后用手触摸，感觉上以不烫手为准。
②平板倒置原因：培养皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
50 ℃
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③注意事项：倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物。
(2)平板划线操作：通过接种环在琼脂固体培养基表面 的操作，将聚集的菌种 到培养基的表面。
(3)稀释涂布平板法：将菌液进行系列稀释后涂布平板，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成 ，从而能在培养基表面形成 。
(4)分离某种特定微生物：用 ，允许特定种类的微生物生长， 其他种类微生物生长。
连续划线
逐步稀释分散
单个细胞
单个的菌落
选择培养基
同时抑制或阻止
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二、微生物的鉴定及数量的测定
1．每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均 ，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
2．鉴定分解尿素的细菌的方法：在以 为唯一氮源的培养基中加入 指示剂，指示剂若 说明该菌种能分解尿素。
3．鉴定纤维素分解菌的方法：利用 染色法，如果培养基中出现 ，则说明很可能含有纤维素分解菌。纤维素分解菌的筛选原理：刚果红可以与 物质形成红色复合物，但并不和水解后的 发生这种反应。
菌落数
尿素
酚红
变红
刚果红
透明圈
纤维素多糖
纤维二糖和葡萄糖
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4．土壤中纤维素分解菌的分离实验方案
(1)土壤取样：采集土样应选择富含 的环境。
(2)选择培养：称取土样，在无菌条件下装入锥形瓶，在一定条件下振荡培养1～2 d，直到培养液浑浊。选择培养的目的是 ，确保分离得到所需的微生物。
(3)梯度稀释：依次将培养液稀释10～107倍。
(4)将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上，30 ℃倒置培养。
(5)挑选产生 的菌落，即为分解纤维素的菌落。
纤维素
增加纤维素分解菌的纯度
透明圈
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(教师资源·备选题库)
1．(2013年黄山模拟)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是( )
A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌
B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板
D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板
解析：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，应先根据需要计算各成分用量，然后称量、溶化、灭菌、倒平板。
答案：C
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幻灯片 92．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )
A．接种环、手、培养基 B．高压锅、手、接种环
C．培养基、手、接种环 D．接种环、手、高压锅
解析：一般说来灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害，操作者的手需要消毒。高压蒸汽灭菌锅是灭菌设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。
答案：C
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幻灯片 103．(2013年深圳模拟)某学者欲研究被石油污染过的土壤中细菌数量，并从中筛选出能分解石油的细菌。下列操作错误的是( )
A．利用平板划线法对细菌进行计数
B．以石油为唯一碳源的培养基筛选
C．采用稀释涂布平板法分离菌种
D．称取和稀释土壤时应在火焰旁
解析：平板划线法能对细菌分离、纯化，但不能进行细菌的计数；由题干信息看出，要筛选出能分解石油的细菌只能以石油作为唯一碳源的选择培养基进行筛选；通常采用稀释涂布平板法分离能分解石油的细菌菌种并且进行计数；为了防止空气中的杂菌进入土样中，称取和稀释土壤时应在火焰旁进行。
答案：A
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4．分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是( )
A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B．富集培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少
C．经稀释培养后，用刚果红染色
D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上
解析：经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；富集培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对照能证明经富集培养的确得到了欲分离的微生物。
答案：A
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幻灯片 12考点一 培养基与微生物纯培养技术
1．培养基的分类及应用
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[特别提醒]
(1)固体、半固体培养基的凝固剂一般不是微生物的营养成分，只起固定作用。常用的凝固剂是琼脂，在低温下呈固态，透明度强，一般不会被微生物分解。
(2)液体培养基营养物质分布均匀，能与菌体充分接触，有利于微生物快速吸收营养，进行菌体繁殖，积累产物，因而适用于大规模工业生产中。
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2．选择培养基及应用实例
(1)选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长，目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。
(2)选择培养基应用实例
①培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。
②培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。
③培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。
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④当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。
⑤改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。
3．培养基的配制原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。因为不同微生物对营养物质的需求不同，如培养自养微生物时，培养基中仅含有简单无机物即可，若要培养异养微生物，则必须含有有机物。
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(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例，如高浓度蔗糖溶液能抑制微生物生长。
(3)pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。细菌适宜pH 6.5～7.5，放线菌适宜pH 7.5～8.5，霉菌、酵母菌适宜pH 4.0～6.0。
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幻灯片 184．微生物的纯培养技术
自然环境中微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物的基本方法：首先将单个的细胞与其他细胞分离开，进而提供细胞合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。
微生物的分散主要采用稀释的方法，而固体培养基能够使分散的细胞固着于一定的位置，与其他的细胞分离，从而生长成为一个单细胞来源的群体即纯培养物。
(1)平板划线法：将合适的无菌培养基倒入无菌培养皿中，冷却后制备成平板。平板划线法中细胞的分离和稀释过程发生在接种环在固体平板表面上的划线和移动过程中，产生的单个细胞在培养基表面生长的后代就是纯培养物。
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(2)涂布平板法：该法用在将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，最常用的液体稀释方法为10倍系列稀释，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。然后，将灭完菌冷却到50～55 ℃的培养基倒入无菌培养皿中冷却形成平板，然后选择细胞得以分散的合适稀释度的菌悬液加到平板中央，以三角刮刀将之均匀地涂布于整个平板上培养即可。
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幻灯片 205．无菌技术操作的方法
(1)灭菌的方法与原理
③酒精灯灼烧法：适用于操作时试管口及接种环的灭菌。
以上三种高温灭菌的原理是使细菌体内蛋白质变性而达到杀灭细菌的目的。
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(2)消毒的方法
①煮沸消毒法：100 ℃煮沸5～6 min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢，可用于培养器皿的消毒。
②巴氏消毒法：在80 ℃煮15 min或在70～75 ℃煮30 min，实际生产中常用于鲜奶的消毒。
③70%乙醇消毒法：70%乙醇杀毒能力最强，常用于实验时操作者手的消毒。
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1．(2013年北京西城测试)某研究性学习小组的同学，为了从土壤中筛选纤维素分解菌，利用下列材料和用具进行了实验，请完善下列实验步骤。
提示：刚果红能与纤维素形成红色复合物，纤维素分解菌在含有刚果红和纤维素的培养基上形成有透明圈的菌落。
材料用具：采集的土样、研钵、配制纤维素分解菌培养基的各种原料、琼脂、纤维素粉、刚果红溶液、培养箱、无菌水。
实验步骤：
(1)利用培养纤维素分解菌培养基的各种原料、琼脂及________________配制固体培养基，灭菌。
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幻灯片 23(2)将采集的土壤样品在研钵中研碎后________________，制成土壤匀浆。
(3)利用无菌操作方法把土壤匀浆________________到培养基上，放在培养箱内培养一段时间。
(4)用显微镜观察纤维素分解菌时，要从____________挑取材料制成临时装片。
解析：分离纤维素分解菌的培养基中要加入纤维素粉做碳源，加入刚果红溶液，刚果红能与纤维素形成红色复合物。采集的土壤样品在研钵中研碎后加入无菌水，制成土壤匀浆。利用无菌操作方法把土壤匀浆点接或接种到培养基上，放在培养箱内培养。纤维素分解菌产生的纤维素酶分解刚果红——纤维素复合物，产生了透明圈。挑取周围有透明圈的菌落制成临时装片可观察到纤维素分解菌。
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答案：(1)纤维素粉和刚果红溶液 (2)加入无菌水
(3)接种 (4)周围有透明圈的菌落
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幻灯片 25考点二 特定微生物的数量的测定
1．测定微生物数量的方法
(1)直接计数法：常用的是显微镜直接计数法。
(2)间接计数法：常用的是稀释平板计数法。
2．测定微生物数量方法的实际应用
(1)土壤中好氧型细菌的计数
①制备土壤稀释液：取土壤表层3～8 cm处的土样；制备系列稀释液。
②取样及倒平板：该实验的接种方法是稀释涂布平板法。
③培养。
④观察记录结果：每克土壤样品菌数＝某稀释倍数的菌落平均数×稀释倍数/涂布平板时所用稀释液的体积。
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(2)检测天然水源中细菌总数和大肠杆菌菌落数
细菌总数通常是指1 g或1 mL检测样品中所含细菌菌落的总数。大肠杆菌菌落数通常是指每100 g或100 mL检测样品中所含细菌的实际数值。
(3)检测某种食品中的细菌总数和大肠杆菌菌落数
一般说来，大肠杆菌菌落总数越多，说明食品的卫生质量越差。
(4)土壤中分解尿素细菌的计数
某些细菌中含有尿素分解酶，能将培养基中的尿素分解成氨，该物质的水溶液会使酚酞指示剂呈现红色。
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3．制备系列稀释液的方法
将1 g土样放入99 mL无菌水中，制成102倍的稀释液，用1 mL无菌移液管吸取上述浓度的溶液0.5 mL，移入装有4.5 mL无菌水的试管中，即配制成103倍的稀释液，用同样的方法可以配制成104、105、106倍的稀释液。将待测样品进行稀释的目的是使微生物细胞分散开，使实验结果更接近真实值。
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2．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株。筛选的主要步骤如下图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：
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幻灯片 29(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源。②中不同浓度碳源的培养基________(A.影响；B.不影响)细菌的数量。如果要测定②中活细菌数量，常采用________法。
(2)④为对照，微生物在④中不生长、在⑤中生长。④与⑤培养基的主要区别在于________________________；使用________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时为什么进行倒置培养？
_______________________________________________________ _______________________________________________。
(3)如何比较不同菌株降解苯酚能力的大小？
_______________________________________________________ _______________________________________________。
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(4)实验过程中如何防止其他微生物的污染？
______________________________________________________________________________________。
解析：本题考查细菌的分离技术。题目中所筛选的细菌“只能”降解苯酚，故可采用以苯酚为唯一碳源的选择培养基筛选，含除苯酚外其他碳源的培养基作为对照。培养液中苯酚浓度下降的速度可反映该菌对苯酚的降解能力，严格灭菌、无菌操作可有效防止实验过程中的杂菌污染。
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答案：(1)苯酚 A 平板菌落计数(活菌计数或菌落计数)
(2)④含除苯酚外的其他碳源，⑤以苯酚为唯一碳源 平板分离(稀释涂布平板或平板划线分离) 避免培养过程产生的水分影响微生物的生长
(3)用同样苯酚浓度的培养液培养不同菌株，一定时间后，测定培养液中苯酚含量
(4)培养基灭菌，接种环灭菌，接种过程无菌操作
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幻灯片 32类型一 培养基的类型及用途
[例1] (2013年内蒙古赤峰质检)下表为某培养基的配方，有关叙述正确的是( )
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A.能在此培养基上生长的大肠杆菌，拟核上有抗青霉素的基因
B．此培养液是天然鉴别培养基
C．此培养基可以用来检测自来水中细菌含量是否符合饮用水标准
D．此培养基可以用于选育转基因大肠杆菌菌种的基因工程的操作过程中
[解析] 此表表示鉴定大肠杆菌的合成培养基；大肠杆菌属原核生物，抗青霉素基因在质粒上。
[答案] D
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幻灯片 35类型二 特定微生物的数量测定
[例2] (2013年北京海淀模拟)通过实验测定土壤中的细菌数量，下列与此操作有关的叙述中，不正确的是( )
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取10－4、10－5的土壤稀释液0.1 mL，分别涂布于各组平板上
C．将培养皿倒置，37 ℃恒温培养24～48小时
D．选择菌落数在300个以上的培养皿进行计数
[解析] 检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时，在确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的平板进行计数。
[答案] D
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类型三 微生物的培养与应用
[例3] (2013年郑州模拟)请回答下列有关微生物的问题。
(1)微生物的分布：微生物主要分布在富含________的土壤表层；不同微生物对pH的要求不同，细菌常生活在酸碱度________的潮湿土壤中。
(2)微生物的消毒和灭菌：在菊花组织培养中，对外植体常用酒精和________进行消毒。在微生物培养中，对培养基常用________方法进行灭菌。静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能________。如果要检测灭菌是否彻底，可以采用的方法是：___________________________________________________。
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(3)微生物的应用：在葡萄酒的自然发酵过程中，运用吸附在葡萄皮上的野生酵母菌发酵产生酒精，请写出该过程的化学反应式：________________。在果醋制作时，运用醋酸菌在________和糖源充足时，将糖分解成醋酸。
(4)微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是________和________。
(5)微生物的计数：根据培养基上出现的菌落数目和稀释倍数计算得出细菌数目往往比实际的数目低，原因是_______________________ ________________________________________________________。
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幻灯片 39(6)微生物的鉴定：为检测尿素分解菌的存在与否，在以尿素为唯一氮源的________(选择、鉴别)培养基中加入________指示剂，如果存在尿素分解菌，则指示剂将变________色。
[解析] (1)微生物主要分布在有机质丰富的土壤表层，细菌常生活在酸碱度接近中性的潮湿土壤中。(2)植物组织培养时，对外植体常用酒精和氯化汞消毒，对培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌；紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构；可通过在适宜的温度下放置灭菌过的培养基看其是否有菌落产生来确定培养基灭菌是否彻底。(3)醋酸菌为需氧型生物。(4)最常用的微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(5)因一个菌落可由多个连在一起的细菌形成，所以计算得出的细菌数一般低于实际数目。(6)用选择培养基筛选目的菌，加入酚红指示剂检测尿素分解菌，若存在尿素分解菌，指示剂变红色。
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[答案] (1)有机质 接近中性 (2)氯化汞 高压蒸汽灭菌 损伤DNA的结构 将灭菌过的培养基在适宜的温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生
(3)C6H12O6 2C2H5OH＋2CO2＋能量 有氧
(4)平板划线法 稀释涂布平板法
(5)当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 (6)选择 酚红 红
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幻灯片 42本小节结束
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