1.2基因工程的基本操作程序
1．基因工程的正确操作步骤是( )
①使目的基因与载体相结合
②将目的基因导入受体细胞
③验证目的基因的表达是否符合特定性状要求
④提取目的基因
A．③②④① B．②④①③
C．④①②③ D．③④①②
解析：选C。在基因工程操作中，首先要提取目的基因，然后使目的基因与载体结合，再将目的基因导入受体细胞，最后是目的基因的检测与表达。
2．下列获取目的基因的方法中需要模板的是( )
①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成DNA
A．①②③④ B．①②③
C．②③④ D．②③
解析：选D。PCR技术利用的是DNA双链复制原理。即将DNA双链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。反转录法是以目的基因转录成的信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链DNA。①④则均不需要模板。
3．聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述30多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55 ℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72 ℃下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是( )
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需酶的最适温度较高
解析：选C。本题考查PCR扩增过程。解题的关键是要全面理解PCR扩增过程。DNA分子被破坏是指DNA分子被解旋成两条长链，破坏的部位是连接两条长链之间的氢键，方法有多种，用解旋酶、高温等都可使DNA解旋。B项中引物有两种，分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对。C项中的原料不正确，合成DNA的原料是四种脱氧核苷酸。PCR技术中DNA合成过程中的温度在70～75 ℃。
4．(2011年重庆高二检测)下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是( )
A．需要限制酶和DNA连接酶
B．必须在细胞内进行
C．抗生素抗性基因可作为标记基因
D．启动子位于目的基因的首端
解析：选B。基因表达载体构建是目的基因与载体结合，在此过程中需用同一种限制酶切割目的基因与载体，用DNA连接酶将相同的末端连接起来；基因表达载体的构建是在细胞外进行的；基因表达载体包括启动子(位于基因首端使转录开始)、终止子、目的基因和标记基因(鉴别受体细胞中是否含有目的基因，如抗生素抗性基因)。
5．我国中科院上海生化所合成了一种具有镇痛作用而又不会像吗啡那样使病人上瘾的药物——脑啡肽多糖(类似于人体中的糖蛋白)。在人体细胞中糖蛋白必须经过内质网和高尔基体的进一步加工才能形成。如果要采用基因工程和发酵工程技术让微生物来生产脑啡肽多糖，应该用下列哪种微生物作受体细胞( )
A．大肠杆菌 B．酵母菌
C．T4噬菌体 D．大肠杆菌质粒
解析：选B。脑啡肽多糖的化学本质类似于人体中的糖蛋白。从题中可以看出，糖蛋白的合成必须经过内质网和高尔基体的进一步加工，内质网和高尔基体只存在于真核生物的细胞内，大肠杆菌是原核生物，只有核糖体，没有内质网和高尔基体，T4噬菌体属于病毒，没有细胞结构，自己不能合成蛋白质；酵母菌是真核生物，其细胞中有内质网和核糖体，可以合成糖蛋白。
6．(2011年池州高二检测)上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛。他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高了30多倍，标志着我国转基因研究向产业化的目标又迈进了一大步。以下与此有关的叙述中，正确的是( )
A．人白蛋白基因开始转录时，在DNA聚合酶的作用下以DNA分子的一条链为模板合成mRNA
B．所谓“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人白蛋白基因
C．人们只能在转基因牛的乳汁中获取到人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在转基因牛的乳腺细胞中是纯合的，在其他细胞中则是杂合的
D．如果人白蛋白基因的序列是已知的，可以用化学方法合成该目的基因
解析：选D。人白蛋白基因开始转录时，在RNA聚合酶的作用下以DNA分子的一条链为模板合成mRNA；所谓“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中的人白蛋白基因更多地进行转录、翻译，产生更多的人白蛋白；人们只能在转基因牛的乳汁中获取到人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在转基因牛的乳腺细胞中表达。
7．(2010年高考江苏卷)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：
限制酶
BamH I
Hind Ⅲ
EcoR I
Sma I
识别序
列及切
割位点
ATCC
CCTA
GCTT
TTCG
ATTC
CTTA
CCGG
GGCC
(1)一个图l所示的质粒分子经Sma Ⅰ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。
(2)若对图中质粒进行改造，插入的Sma Ⅰ酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma Ⅰ切割，原因是 ________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)与只使用EcoR Ⅰ相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止
________________________________________________________________________。
(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________________酶。
(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在________________________________的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。
解析：(1)该质粒为环状DNA，经Sma Ⅰ切割前，不含有游离的磷酸基团，经Sma Ⅰ切割后形成平末端，含有2个游离的磷酸基团。
(2)Sma Ⅰ识别的是CCCGGG序列，切割点在C与G之间，Sma Ⅰ酶切位点越多，也就是C－G碱基对越多，C与G之间的氢键(3个)比A与T之间的氢键(2个)数量多，其含量越多，质粒的热稳定性越高。
(3)据图1可知，Sma Ⅰ切割位点在抗生素抗性基因(标记基因)中，据图2可知，Sma Ⅰ切割位点在目的基因中，因此使用Sma Ⅰ切割会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因。
(4)用同一种限制酶处理质粒和外源DNA，再用DNA连接酶连接时，往往会有三种连接形式：目的基因—质粒、目的基因—目的基因(环化)、质粒—质粒(环化)，后两种是我们不需要的，因而要进行筛选。用两种限制酶处理质粒和外源DNA，因形成的末端不同可避免上述情况的发生。
(5)连接质粒与目的基因的工具酶是DNA连接酶。
(6)抗生素抗性基因是标记基因的一种，标记基因的作用是供重组DNA鉴定和筛选。
(7)可根据目的基因是否表达成预期的蛋白质进行目的基因的检测，本题中预期的蛋白质是蔗糖转运蛋白，因而可在蔗糖为惟一含碳营养物质的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。
答案：(1)0、2 (2)高
(3)Sma Ⅰ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因
(4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
(5)DNA连接
(6)鉴定和筛选含有目的基因的细胞
(7)蔗糖为惟一含碳营养物质
(紧扣教材，思考感悟)
【寻根问底】
1．为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的生物体内提取不行吗？(教材P9)
答案：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，但并不是唯一的方法。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全部基因组序列，往往就需要构建基因文库。
2．将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？(教材P11)
答案：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过基因枪法或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。
1．有关基因工程叙述正确的是( )
A．限制酶只在获取目的基因时才用
B．重组质粒的形成是在细胞内完成的
C．质粒都可以作为运载体
D．蛋白质的氨基酸排列顺序可能为合成目的基因提供线索
解析：选D。在基因工程中，不仅要用限制酶切割目的基因，还要用同一种限制酶在质粒上切割出一个切口，使目的基因与质粒切口的黏性末端能进行碱基互补配对；重组质粒是在细胞外进行的；并不是所有的质粒都可作为运载体，在科学研究中，人们通常只是用大肠杆菌的质粒(其上有抗药基因)作运载体；在人工合成目的基因的方法中，有一种方法是根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，最后通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
2．PCR技术扩增DNA，需要的条件是( )
①目的基因 ②引物 ③四种脱氧核苷酸 ④耐高温的DNA聚合酶 ⑤mRNA ⑥核糖体 ⑦能量
A．②③④⑤⑥ B．①③④⑦
C．①②③⑤⑥ D．①②③④⑦
解析：选D。PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，条件是有一段已知的目的基因的核苷酸序列和根据核苷酸序列合成的引物，原料是四种脱氧核苷酸，也需要多种酶，如DNA聚合酶。
3．下列关于基因表达载体的构建描述错误的是( )
A．基因表达载体的构建是基因工程的核心
B．基因表达载体的构建包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分
C．目的基因就是指编码蛋白质的结构基因
D．构建的基因表达载体都是相同的
解析：选D。本题综合考查了基因表达载体构建的基础知识包括基因表达载体构建在基因工程中的地位、结构组成，不同生物的基因表达载体的不同等。基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心；一个基因表达载体的组成除目的基因外还有启动子、终止子、标记基因等部分；由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有差别。
4．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是( )
A．结构简单，操作方便
B．繁殖速度快
C．遗传物质含量少、简单
D．性状稳定，变异少
解析：选B。本题考查基因工程的受体细胞。目的基因导入受体细胞后，随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌等微生物繁殖速度非常快，故在很短时间就能获得大量的目的基因。
5．下列关于目的基因导入受体细胞的描述不正确的是( )
A．基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济有效
B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C．大肠杆菌最常用的转化方法是：使细胞的生理状态发生改变
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
解析：选A。本题综合考查了将目的基因导入细胞的方法。不同生物目的基因导入的方法不同，每种方法都有利有弊。目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济有效，还有基因枪法和花粉管通道法；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法；大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，完成转化过程。
6.(2011年哈尔滨高二检测)科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果长成的植株才有了抗虫能力。由以上过程推知，作为目的基因的载体应具备的结构是( )
A．目的基因、启动子
B．目的基因、终止子
C．目的基因、启动子、终止子
D．目的基因、启动子、终止子、标记基因
答案：D
7．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是( )
①检测受体细胞是否有目的基因 ②检测受体细胞是否有致病基因 ③检测目的基因是否转录出mRNA ④检测目的基因是否翻译成蛋白质
A．①②③ B．②③④
C．①③④ D．①②④
解析：选C。本题考查目的基因的检测的相关知识。目的基因的检测包括：检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA探针，使DNA探针与基因组DNA杂交。检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用基因探针与mRNA杂交。最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是进行抗原—抗体杂交。
8．在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要( )
①DNA连接酶 ②同一种限制酶 ③RNA聚合酶 ④具有标记基因的质粒 ⑤目的基因 ⑥4种脱氧核苷酸
A．③⑥ B．②④
C．①⑤ D．①②④
解析：选A。在基因工程的操作过程中，需要用同一种限制酶切割目的基因与载体，并用DNA连接酶将两者的黏性末端(或平末端)连接起来，所选择的质粒必须具有标记基因，以便进行目的基因的检测。
9．(2011年西安高二检测)下列哪项表述说明了目的基因表达成功( )
A．用DNA探针检测目的基因出现杂交带
B．用DNA探针检测mRNA出现杂交带
C．用抗原—抗体杂交检测蛋白质出现杂交带
D．以上都不能说明
解析：选D。目的基因表达成功需从两个方面检测：一是分子水平检测。包括检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因，检测目的基因是否转录出mRNA，检测目的基因是否翻译成蛋白质。二是个体水平检测。如抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验。
10．下列关于基因工程的叙述，错误的是( )
A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
解析：选D。基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶；人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性，只有经过一定的物质激活以后，才有生物活性；载体上的抗性基因主要是有利于筛选含重组DNA的细胞，不能促进目的基因的表达。所以D错误。
11．聚合酶链式反应(PCR)是生物学家在实验室以少量样品制备大量DNA的生化技术，反应系统中包括微量样品基因、DNA聚合酶、引物、4种脱氧核苷酸等。反应中新合成的DNA又可作为下一轮循环反应的模板，其过程如图所示，据图回答问题：
(1)为什么通过此反应产生的DNA与样品完全一样？
________________________________________________________________________。
(2)每次此循环反应完成时产生两分子DNA，如果该DNA样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A∶G∶T∶C＝1∶2∶3∶4，则五次循环后将产生多少个DNA，________个，需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数目至少是________个。
(3)指出此过程与转录过程的三个不同点：
①________________________________________________________________________
________________________________________________________________________；
②________________；③________________。
解析：本题将基因工程知识与DNA分子复制等知识结合在一起，DNA分子的复制是半保留复制，所以复制五次，可以得到32个DNA分子，而新合成的DNA分子数目相当于31个，在一个DNA分子中有胸腺嘧啶脱氧核苷酸200个，所以需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数目至少是6200个。
聚合酶链式反应(PCR)技术是在人为条件下进行的DNA分子复制技术，而转录是形成mRNA的过程，故二者有很多不同之外。
答案：(1)新产生的DNA是以样品DNA为模板合成的
(2)32 6200
(3)PCR以DNA的两条单链为模板，转录时以DNA的一条单链为模板 所用的原料不同 催化反应的酶不同
12．(2011年青岛市高二质检)如图为某种质粒表达载体简图，
小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRⅠ、Bam HⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRⅠ、Bam HⅠ在内的多种酶的酶切位点。
据图回答：
(1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有
________________________________________________________________________
________________、______________________________、____________________________三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行________。
(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是________________________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是
________________________________________________________________________
________________________________。
(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是________________，其合成的产物是________________。
(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是
________________________________________________________________________。
解析：(1)将含有目的基因的DNA与质粒用EcoRⅠ酶切开后，可形成许多有相同末端的DNA片段，再用DNA连接酶连接起来后，可形成目的基因与目的基因、目的基因与载体、载体与载体连接的重组DNA分子，而基因工程所需要的是目的基因与载体的连接物，所以对以上三种DNA分子片段进行分离提纯，以获得基因工程所需要的。
(2)质粒是原核生物细胞中的一种DNA分子，所以对以上连接物，只有含载体与载体的连接物的宿主细胞能生活在含四环素的培养基中。而目的基因与载体连接物、载体与载体的连接物都含有完整的青霉素抗性基因，所以可生活在含有青霉素的培养基上。
(3)目的基因表达时，RNA聚合酶与启动子结合，催化DNA分子转录为信使RNA分子。
(4)为了防止目的基因与质粒表达载体的任意连接，可同时选用EcoR↓I酶与BamH I酶切割目的基因和质粒，这样形成的目的基因两个末端分别有不同的核苷酸序列，而质粒的两个末端也是分别有不同的核苷酸序列，这样就能保证目的基因只能与质粒结合了。
答案：(1)目的基因——载体连接物 载体——载体连接物 目的基因——目的基因连接物 分离纯化
(2)载体——载体连接物 目的基因——载体连接物、载体——载体连接物
(3)启动子 mRNA
(4)EcoRⅠ和BamHⅠ
13．萤火虫能发光是因为萤火虫体内可以通过荧光素酶催化的系列反应所产生的现象。如果荧光素酶存在于植物体内，也能使植物体发光，一直以来荧光素酶的唯一来源是从萤火虫腹部提取的。但加利福尼亚大学的一组科学家成功地通过基因工程实现了将荧光素酶基因导入到大肠杆菌体内，并在大肠杆菌体内生产荧光素酶。
请你根据已知的知识回答下列有关问题：
(1)提取目的基因通常有两种途径，提取该目的基因的方法最可能的途径是________________________。
(2)在该过程中需要多种酶的参与，其中包括
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________等。
(3)下列可作为受体细胞的生物有(多选)( )
A．土壤农杆菌 B．结核杆菌
C．噬菌体 D．枯草杆菌
(4)在此转基因工程中，是由质粒承担运载体的。在将体外重组DNA插入大肠杆菌体内之前通常要用________处理大肠杆菌，目的是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)由于荧光素酶的特殊作用，人们一直设想将其基因作为实验工具，将它和某一基因连接在一起导入植物体内，如固氮基因连接在一起导入植物体内，判断固氮基因是否导入的方法是________________________________________________________________________。
(6)与杂交育种、诱变育种相比，通过基因工程来培育新品种的主要优点是________________________和________________________。
答案：(1)人工合成法 (2)限制性核酸内切酶、DNA连接酶 (3)AD (4)Ca2＋ 增大细胞壁的通透性，使重组质粒能够导入到受体细胞内 (5)检测植物是否发光
(6)目的明确、培育周期短、可以克服远缘杂交不亲和性(只要合理，两点即可)
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