一．凝胶色谱法
(1)概念：凝胶色谱法也称作_分配色谱法_,是根据_相对分子质量大小_分离蛋白质的有效方法。
(2)原理：大多数凝胶是由_多糖类化合物__构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程_较长____，移动速度_较长__；而_相对分子质量较大_的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在_凝胶外部__移动，路程_较短___，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离，即分子质量大的蛋白质、分子质量中等的蛋白质和分子质量小的蛋白质洗脱出来的先后顺序为 分子质量大的蛋白质最先洗脱出来、分子质量中等的蛋白质第二洗脱出来，分子质量小的蛋白质最后被洗脱出来 。
二．缓冲溶液
(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制_外界酸和碱_对溶液_PH___的影响，维持pH基本不变。
(2)配制：通常由_1-2____种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的_使用比例 就可以制得 不同PH范围内的 缓冲液。
三．电泳
(1)概念：带电粒子在 电场 的作用下发生 迁移 的过程。
(2)原理：许多重要的生物大分子，如_多肽_____、_核酸_____等都具有__可解离______的基团，在一定pH下，这些基团会带上__正电____或__负电_____。在电场的作用下，这些带电分子会向着_与其所带电荷相反的电极__移动。电泳利用了分离样品中各种分子_带电性质差异__以及分子本身的_大小____、_性状的___不同，使带电分子产生不同的__迁移速率__，从而实现样品中各种分子的分离。
四．蛋白质提取分离一般分为_红细胞的洗涤_、_血红蛋白的释放_、_分离血红蛋白、___透析_。
五．实验操作
I．样品处理
实验选取的是 哺乳动物成熟 红细胞为材料，原因是 没有细胞核及其它较多的细胞器 ，
血红蛋白由_4条___肽链组成，包括两个__α-肽链____和两个_β-肽链________。每条肽链环绕一个_亚铁血红素___基团，此基团可携带_一分子氧__或__一分子二氧化碳__。血红蛋白因含有血红素而呈现_红色_______。
(1)红细胞的洗涤
①目的：去除 杂蛋白 。
②方法：_低速______离心，如500 r·min离心2 min，然后用胶头吸管吸出上层透明的_黄色血浆____，将下层_暗红色______的红细胞液体倒入_烧杯____，再加入_五倍体积_ _的生
理盐水，缓慢搅拌_10min__ _，低速短时间离心，如此重复洗涤_3__ _次，直至上清液中没有_黄色_____，表明红细胞已洗涤干净。
(2)血红蛋白的释放：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加_蒸馏水_到原血液的体积，再加40％的_甲苯_，置于_磁力搅拌器_上充分搅拌10 min。该步骤的目的使红细胞破裂，释放血红蛋白 。
(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液离心后可观察到试管中溶液分为4层。
第1层：_无色透明___ 的甲苯层
第2层：_脂溶性物质___的沉淀层——_白色____ _薄层固体
第3层：_血红蛋白_____的水溶液——_红色透明_透明
第4层：其他杂质的_暗红色_______色沉淀物
将液体用_滤纸_____过滤，除去_脂溶性沉淀层__，于_分液漏斗___中静置片刻后，分出下层的_红色透明________液体。
(4)透析
①过程：取1 mL的__血红蛋白___溶液装入_透析袋_ _中，将其放入盛有300 mL的20 mL·L的_磷酸缓冲液_____中(pH = __7.0____)，透析12 h。
②原理：透析袋能使 小分子 自由进出，而将 大分子 保留在袋内。
③目的：可以除去 样品中分子量较小的杂质 ，或用于 更换样品的缓冲液
测定（ 蛋白质相对分子质量 ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。
为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( SDS )。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是
( 单条肽链的分子量 )。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( 分子的大小 )。
凝胶色谱操作
(1)凝胶色谱柱的制作
①柱底部的制作
a．选择合适的橡皮塞，中间打孔。
b．在橡皮塞顶部切出锅底状__凹穴____，在0.5 mL的_移液管____头部切下_5cm_____长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超出橡皮塞的凹穴底面。
c．剪尼龙网小圆片覆盖在_橡皮塞的凹穴上 。用_大小合适的100目_的尼龙纱将橡皮塞___上部 包好，插到玻璃管一端。
d．色谱柱下端用移液管头部作_出口部位_ _，连接一细的_尼龙管___，并用_ 螺旋夹 控制尼龙管的_打开____与__关闭_____，另一端放入收集_色谱流出液______的收集器内。
②柱顶部的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞。
(2)凝胶色谱柱的装填
①填充材料：交联葡聚糖凝胶。
②方法：凝胶用_蒸馏水___充分溶胀后，配成_凝胶悬浮液__，在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入_色谱柱内____。注意色谱柱内不能有 气泡 存在，一旦发现，色谱柱必须 重装
装填完后，立即连接_缓冲液洗脱瓶___，在_约50cm__高的操作压下，用300 mL的20 mol·L的磷酸缓冲液充分_洗涤______平衡凝胶12 h，使凝胶装填_紧密_____。
(3)样品的加入和洗脱
①加样前：打开流出口，使柱内凝胶面上的_缓冲液____下降到与_凝胶面__平齐，关闭出口。
②加样：用_吸管__将1 mL_透析后的样品____的样品加到色谱柱的_顶端______。
③加样后：打开_下端出口____，使样品渗入凝胶床内，等完全进入后，关闭下端出口。小心加入缓冲液到_适当高度______，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每_5ml_______收集一管，连接收集。
Ⅲ．SDS--聚丙烯酰胺凝胶电泳判断 纯化 的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。在血红蛋白的分离中，其分离成功的标志 红色区带均匀一致的移动 。
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