专题2 微生物培养与应用 专题复习
典型例题：
例1. 某学校打算开辟一块食用菌栽培基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽培所需的各种原料和用具，然后从菌种站购来各种食用菌菌种。请回答下列问题：
（1）对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料： 、 、 、 、 。其中提供氮源的是 ；提供能源的主要物质是 。
（2）微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，配制培养基时各成分要有合适的 。在烧杯中加入琼脂后要不停地 ，防止 。
（3）将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后将若干个试管捆在一起，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，压力 kPa，温度 ，时间 。灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应 。
（4）使用高压蒸汽灭菌锅时应注意，先向锅内倒入适量的水。把锅内水加热煮沸并将其中原有的 彻底排出后再将锅密闭。
【解析】本题考查牛肉膏蛋白胨固体培养基的成分及其作用。培养基的配置原则、方法以及灭菌的相关内容。根据上述讲解内容，固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料包括五种成分，为牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水以及凝固剂琼脂；其中牛肉膏和蛋白胨都含有氮元素，可以提供氮源，由于牛肉膏富含水溶性糖，还可以提供能源；配置培养基的原则是目的明确，营养要协调，pH要适宜，因此我们可以确定培养基中各成分要有适合的比例，由于琼脂作为凝固剂，在加热熔化的过程中易糊底导致局部温度过高引起烧杯破裂，因此可采用不断搅拌的方法加以避免；高压蒸汽灭菌要求100 kPa，121℃条件下持续半小时后关闭电源，待冷却后取出试管搁置斜面，如果试管的棉塞沾有培养基，未能避免污染培养物则应该废弃不用；高压灭菌过程中，由于冷空气的密度大，所以加热煮沸后放出冷空气才能使锅内达到特定气压和达到特定的温度，否则灭菌效果差。
【答案】（1）牛肉膏 蛋白胨 水 无机盐 琼脂 蛋白胨、牛肉膏 牛肉膏
（2）比例 搅拌 琼脂糊底引起烧瓶破裂 （3）100 121℃ 15～30min 废弃 （4）冷空气
例2. 分析下面培养基的配方：
KH2PO4、Na2 HPO4、MgSO4·7H2O 、葡萄糖、尿素、琼脂。
请回答：（1）在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是 和 。
（2）该培养基为 培养基（按物理状态分），因为培养基中含有 。
（3）想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果有，又是如何进行选择的？
。
（4）在以尿素作为唯一氮源的培养基上分离的微生物一定是尿素分解菌吗？ 。为什么？ 。
【解析】本题考查培养基的类型、作用等知识。题中所给的KH2PO4、Na2 HPO4、MgSO4·7H2O为无机盐，葡萄糖作为碳源、尿素作为氮源，琼脂作为凝固剂，因此冷却后的培养基为固体培养基；由于培养基中尿素作为唯一氮源，因此可以作为分解尿素的微生物的选择培养基；但是有些微生物可以利用尿素合成其他代谢产物，因此该培养基上培养的微生物并不一定分解尿素。
【答案】（1）葡萄糖 尿素 （2）固体 凝固剂琼脂
（3）有选择作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够分解尿素的微生物才能生长
（4）不一定。因为有些微生物可以利用尿素分解菌代谢产生的含氮代谢产物生长繁殖。
模拟试题：
1.某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌（目的菌）。实验的主要步骤如下图所示。请分析完成下列问题：
（1）培养基中加入化合物A的目的是筛选 ，这种培养基属于 培养基。
（2）“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的 ，实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是 。
（3）在上述实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是 。
（4）转为固体培养时，常采用平板划线的方法进行接种，此过程所用的接种工具是 ，操作时采用 灭菌的方法。
（5）实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，这样做的目的是 。
2.选择培养是微生物学中最强有力的技术手段之一。主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定环境条件，使仅适应该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离得到所需的特定微生物。选择条件可根据所需分离的微生物的特点，从物理、化学、生物及多个方面进行综合选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。如图描述了采用选择培养方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。
（1）本实验所需培养基为 ，碳源为 。
（2）实验原理是 。
（3）①—③重复培养的目的是 。
（4）⑤的菌落中大部分是降解 的微生物。
（5）⑥为 组，⑦为 组，设置⑥的目的是
。
（6）在接种操作过程中为防止污染应注意的事项是 。
3.根据各类微生物的形态结构特点和新陈代谢类型，利用选择性培养基和鉴别培养基，结合显微镜检以及菌落特征，可以把混杂在一起的大肠杆菌、硝化细菌、乳酸菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、圆褐固氮菌分离开来。下面是分离筛选的方法步骤，请根据各个步骤的条件，填写空格中的内容。
首先配制一系列不同性质的固体培养基，然后进行灭菌。再将上述微生物的混合液分别接种到各种培养基上进行培养。
⑴用无氮培养基可以筛选出 。
⑵用不含有机碳源的选择培养基可以筛选出 。
⑶酵母菌的筛选需要在常规培养基另加入 。
⑷用加入了较高浓度的NaCl的选择培养基可以筛选出 ，或者根据菌落的颜色呈现 色，将其挑取单独培养。
⑸利用伊红－美蓝培养基培养混合菌，菌落呈 色，并带有金属光泽的是 ，挑取单个菌落培养。结合显微镜检和进一步用伊红－美蓝培养基鉴别来确定。
⑹在无氧条件下培养混合菌， 可以生长，加入一定浓度的乳酸，使培养基pH充分降低，可抑制 菌的生长，利用菌落特征，结合显微镜检，选取生长优势的菌落，即可分离出 。
4.蓝色牛仔裤常选用质地较粗的棉布料，为了美观和穿着舒适，以往采用“石洗”法，把成捆的布料和浮石放在机器中翻滚，使它变得柔软。现在改用“生物石洗”法，用含有纤维素酶和蓝靛染料的溶液水洗布料，当达到一定柔软度时，冲洗掉纤维素酶。
（1）自然界中纤维素的来源是___________________。它是_________________________的基本组成成分。纤维素酶能使布料柔软的原因是_______________。
（2）由于不同种生物间存在着_____________，为获得作物新品种。在植物细胞工程的 ______________中，纤维素酶和_____________可用于制备____________，通过植物组织培养得到杂种植株，从而克服_________________________________________的障碍。
（3）某研究性学习小组同学，为了从土壤中筛选纤维素分解菌，利用下列材料和用具进行了实验，请完善下列实验步骤。提示：刚果红能与纤维素形成红色复合物，纤维素分解菌在含有刚果红和纤维素的培养基上形成有透明圈的菌落。
材料用具：采集的土样，研钵，配制纤维素分解菌培养基的各种原料，琼脂，纤维素粉，刚果红溶液，培养箱，无菌水。
实验步骤：
①利用培养纤维素分解菌培养基的各种原料、琼脂及__________________ 配制固体培养基，灭菌。
②将采集的土壤样品在研钵中研碎后_____________________________，制成土壤匀浆。
③利用无菌操作方法把土壤匀浆___________到培养基上，放在培养箱内培养一段时间。
④用显微镜观察纤维素分解菌时，要从____________________挑取材料制成临时装片。
5. 在做土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验时，出现如下问题，请给予解答：
（1）一位同学用稀释倍数为106的稀释液在培养基中涂布了3个平板，统计的菌数数为21、212和256，该同学以这3个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这一结果是否接近真实值？如果需要改进，如何改进？___________________________________________________________。
（2）A同学筛选出的菌落为150个，其他同学只选择出50个，并且他在设计实验时并没有设置对照。你认为A同学结果产生的原因可能有哪些？_________________________。如何设计对照实验排除可能影响实验结果的因素：____________________________ _____。
6.微生物与人类关系密切。虽然有些微生物能使动植物患病，但多数微生物对人类是有益的。请回答有关微生物及其应用的试题：
(1)培养微生物的培养基配方中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。从土壤中分离分解尿素的细菌时，培养基中加的唯一氮源为 ，这种培养基称为 培养基。
(2)在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的倒平板操作时，平板冷凝后，为什么要将平板倒置? ___________________________
(3)微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和 法。在用平板划线法接种时，为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环?
在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗?为什么? 。
7.某同学分离纤维素分解菌，如下试验
纤维素粉
5g
NaNO3
1g
KH2PO4
0.9g
MgSO4.7H2O
0.5g
KCL
0.5g
NaHPO4.7H2O
1.2g
酵母膏
0.5g
水解酪素
0.5g
将上述物质溶解后， 用蒸馏水定容到1000mL
CMC－Na
5~10g
酵母膏
1g
KH2PO4
0.25g
琼脂
15g
土豆汁
100mL
将上述物质溶解后， 用蒸馏水定容到1000mL
A培养基 B培养基
（1） 采集土样：应该到_____________环境中采集
（2） 选择培养：应选择图中______培养基，选择培养的目的是__________________
（3） 梯度稀释
（4） 接种到鉴别培养基上：应选图中的_________培养基，接种方法为________________，利用____________与纤维素形成红色复合物来筛选纤维素菌，筛选出纤维素分解菌的这种方法为__________________。
（5） 挑选菌落：挑选出产生____________的菌落。
参考答案：
1.（1）目的菌 选择 （2）化合物A 异养需氧型 （3）防止外来杂菌的入侵 （4）接种环 灼烧 （5）防止造成环境污染
2.（1）选择培养基 对羟基苯甲酸
（2）利用以对羟基苯甲酸为唯一碳源的选择培养基，经选择培养，选择出能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物
（3）增大分解对羟基苯甲酸微生物的浓度
（4）对羟基苯甲酸
（5）对照 实验 说明通过选择培养确实得到了欲分离的目标微生物 （6）操作都在酒精灯火焰的附近进行
3.⑴圆褐固氮菌 ⑵硝化细菌 ⑶青霉素 ⑷金黄色葡萄球菌 金黄 ⑸深紫 大肠杆菌 ⑹乳酸菌和酵母菌 酵母 乳酸菌
4.（1）光合作用合成的有机物转化而来 植物细胞壁 纤维素酶水解棉布中的一些纤维素（2）生殖隔离 体细胞杂交 果胶酶 原生质体 远源杂交不亲和（3） ①纤维素粉和刚果红溶液②加入无菌水 ③点接或接种 ④周围有透明圈的菌落
5.（1）不接近真实值，接种前将菌液摇匀后重新实验
（2）可能是土样不同，也可能是培养基污染或操作失误；
方案有二：一是由其他同学用与A同学一样的土壤进行实验，如果与A同学一致，则证明无误，如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。
6.(1)尿素 选择
(2)皿盖上会凝有水珠，防止水珠落人培养皿造成污染，还可使培养基表面的水分更好挥发
(3)稀释涂布平板
第一步灼烧接种环是防止接种环上有其它微生物而污染培养基。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次接种时留下的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，以便通过多次划线后，得到单个的菌落 划线结束后仍要灼烧接种环， 以免菌种对环境造成污染。
7.（1）富含纤维素 （2）A 增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物 （4）B 稀释涂布 刚果红 刚果红染色法 （5）透明圈
点击高考：
1.（07宁夏理综）32．生物选考题（15分）
A．[生物———选修I生物技术实践]
某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。
（1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了____和______。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是_____和______。
（2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是_______。
（3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于______中培养，培养的温度设定在37℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种______作为对照进行实验。
（4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有_____种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越_______。
（5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐_______细菌，这种培养基被称为____。
【解析】（1）蛋白质中含有C、N元素，为细菌培养提供氮源和碳源，淀粉只能提供碳源。（2）培养基采用高压蒸汽进行灭菌效果好。（4）不同微生物形成的菌落不同，有多种菌落即有多种细菌；污染程度越重，菌落总数越多。（5）耐盐细菌可以在高浓度NaCl培养基中生存。
【答案】（1）氮源（碳源不作要求） 碳源、无机盐、水 （2）高压蒸汽灭菌
（3）恒温培养箱 无菌水 （4）多；高 （5）盐（或NaCl），选择性培养基
2.(08广东生物)38．（生物技术实践，10分）
苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品，请回答下列问题：
（1）②中培养口的菌株的选择培养基中应加入 作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基 （A.影响；B.不影响）细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用 法。
（2）④为对照、微生物在④中不生长、在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于 ；使用 法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时为什么进行倒置培养？
（3）如何比较不同菌株降解苯酚能力的大小？
（4）实验过程中如何防止其它微生物的污染？
【解析】题目中所筛选的细菌“只能”降解苯酚，故可采用以苯酚为唯一碳源的选择培养基筛选，用含除苯酚外其他碳源的培养基作为对照。培养液中苯酚浓度下降的速度可反映该菌对苯酚的降解能力，严格灭菌、无菌操作可有效防止实验过程中的杂菌污染。
【答案】（1）苯酚 A 平板菌落计数（活菌计数或菌落计数） （2）④含除苯酚外的其他碳源，⑤以苯酚为唯一碳源 稀释涂抹平板或平板划线分离 避免培养过程产生的水分影响微生物的生长。 （3）用同样苯酚浓度的培养液培养不同菌株，一定时间后，测定培养液中苯酚含量。 （4）培养基灭菌，接种环灭菌，接种过程无菌操作。
3.（09上海39）．氯苯化合物是重要的有机化工原料，原因不易降解，会污染环境。某研究小组依照下列实验方案（图1）筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌，培养基配方如表1。
（1）配制Ⅱ号固体培养基时，除添加Ⅱ号液体培养基成分外，还应添加1%的____________。
（2）培养基配制时，灭菌与调PH的先后顺序是____________。
（3）从用途上来说，Ⅰ号培养基和Ⅱ号培养基分别属于____________培养基和____________培养基。在Ⅱ号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是____________。
（4）在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为
____________。
（5）将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的Ⅲ号培养液中培养，得到生长曲线（如图2）。从图2可知SP1菌在____________培养条件下最早停止生长，其原因是____________。
【解析】本题主要考查微生物相关知识。
（1）固体培养基必须含有适量的琼脂；
（2）配置培养基时应先调PH后灭菌；
（3）Ⅰ号培养基是为了获得更多的菌株，属于通用培养基，Ⅱ号培养基是为选择出SP1菌株属于选择培养基，Ⅱ号培养基成分中含N物质为硝酸铵，则应由它为SP1菌株提供氮源；
（4）在恶劣环境下一些菌体会形成芽孢休眠体，来度过不良环境；
（5）SP1菌株是以氯苯为碳源，当氯苯消耗尽菌株因缺少碳源而不能继续生存，故氯苯含量越少，SP1菌株越早停止生长。
【答案】（1）琼脂（2）先调PH，后灭菌（3）通用 选择 硝酸铵
（4）芽孢（5）20mg/L氯苯 硝酸最早耗尽
4.（09宁夏理综40）
（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑______、______和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、______、______等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。
（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行________（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和______；静止于空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能__________。
（3）若用稀释涂抹平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_______。
（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的____________。
（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_________。
（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_______处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
【解析】（1）大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、易培养、生活周期短
等优点，培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。
（2）灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,所以对培养基和培养皿进行灭菌，消毒：使用较为温和的物理或化学方法，仅能杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物, 操作者的双手需要进行清洗和消毒, 紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构.
（3）稀释涂抹平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养,应保证样品稀释的比例适合.
（4）对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的鉴定.
【答案】（1）温度 酸碱度 易培养 生活周期短（2）灭菌 消毒 损伤DNA的结构
（3）比例合适（4）鉴定（或分类）
（5）将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生.
（6）灭菌
5.(08山东)34．【生物—生物技术实践】
科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。
（1）分离该抗菌蛋白可用电泳法．其原理是根据蛋日质分子的 、大小及形状不同，在电场中的 不同而实现分离。
（2）可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白的体外抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供 和 。
（3）分别在加入和未加入该抗菌蛋白的培养基中接种等量的菌液培养基中菌落的 ，确定该蛋白的抗菌效果。
（4）细菌培养常用的接种方法有 和 。实验结束后，对使用过的培养基应进行 处理。
答案：
(1)电荷(带电情况) 迁移速度 (2)碳源 氮源
(3)数量 (4)平板划线法 稀释涂布平板法(稀释混合平板法) 灭菌
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